痛风石的微观结构及化学成分的测定

白 雪，张洪博，尹相林2，，姚嵩坡2，，王嘉淇2，，孙雪薇2，，张睿迪，关宝生2，

（1.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.黑龙江省痛风研究重点实验室，黑龙江 佳木斯 154007；3.佳木斯大学公共卫生学院，黑龙江 佳木斯 154007）

痛风是由于机体内尿酸分泌增多和（或）排泄障碍导致尿酸盐逐渐在关节周围沉积伴钙化，最后形成痛风石，局部骨质进一步被破坏，出现骨侵蚀，并对关节造成不可逆性损伤［1-3］。也有证据表明，足部或踝部的痛风石可能会导致肌肉活动减弱，从而导致肌肉萎缩［4］。据报道，全球痛风的患病率为0.1%～10.0%，每年发病率为0.3～6例/1 000人［5］。中国高尿酸血症相关疾病诊疗多学科专家共识中提到，我国不同地区的高尿酸血症患病率为5.46%～19.30%，痛风患病率为0.86%～2.20%［6］，已成为继糖尿病之后又一常见代谢性疾病。最近，有研究发现痛风患者死亡率的升高与体内痛风石的存在有关［7］。痛风主要表现为部分关节畸形，反复发作的剧烈疼痛，其模式类似于类风湿关节炎［8-12］。在痛风的诊断标准中最重要的一项是关节腔中是否存在痛风石［13］。痛风石最先发于第一跖趾关节，随着病情逐渐加重可能发生在指、腕、肘及膝等关节处［14-16］。有研究发现，痛风石在电镜下有两种形态：一种是柱状晶体，聚集形成球状物，被组织包裹；另一种呈颗粒状，堆积呈现块状。另外，痛风石样品中自由水和结合水约占9%，尿酸成分约占56%，无机盐成分约占9%，其他有机成分约占14%［17］。因此，本研究重点分析痛风患者身体不同部位痛风石的形貌、化学成分及所含化学元素，有利于进一步认识痛风的发病机制及病理过程，为减轻尿酸盐诱发的炎症反应提供理论依据，为痛风诊治提供新思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象

痛风的诊断参照中国高尿酸血症与痛风诊疗指南（2019）［18］，3 名研究对象来自于佳木斯中医院，分别从3 名研究对象的膝关节或肘关节或足关节处取出痛风石作为研究样本，患者签署知情同意书（伦理委员会许可证编号：JMSU-194）。

1.2 实验试剂

枸橼酸溶液（博士德生物有限公司）、无水乙醇（国产分析纯）、吐温-20、β-巯基乙醇（美国Biosharp）、PBS（博士德生物有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 H＆E 染色 将手术获得的痛风石组织置于4%多聚甲醛中固定，石蜡切片并用伊红溶液染色，在显微镜进行观察和拍照。

1.3.2 扫描电镜与能谱分析 将痛风石粉末样品固定于取样台，设定工作电压为20 kV，工作距离分别为50、100、200、500 μm，将痛风石粉末样品放大50 倍、100 倍、500 倍观察其扫描图像。随后截取特定区域进行能谱分析，调整数值并生成图谱。

1.3.3 X 荧光分析 设定测量时间为3～5 min，取充分研磨后的痛风石粉末置于设备样品室中进行测试，并保存分析曲线。

1.3.4 X 射线衍射 取充分研磨后的痛风石粉末置于设备的样品槽中，设置合适的衍射条件及参数，进行X 射线粉末衍射，最后记录其谱图并进行分析。

2 结果

2.1 痛风石组织结构观察

在光学显微镜下观察，痛风石组织被伊红染成不同程度的红色，可在镜下观察到尿酸盐结晶呈针形、放射状，周围有成纤维细胞、多核巨细胞、淋巴细胞的包裹。图1 中黑色箭头所指为组织中的尿酸盐结晶，即为痛风石。见图1。

图1 不同部位痛风石组织的H＆E 染色（200×）Fig 1 H＆E staining of tophi tissues in different parts of human body（200×）

2.2 痛风石扫描电镜观察

对痛风患者不同部位的痛风石进行扫描电镜观察，结果显示，析出相较多的有近似圆形和椭圆形两种形貌，析出相较亮的是重元素区，基体较暗的是轻元素区；图像中明亮处为痛风石，可见痛风石均为大小不一的块状结构，形状不规则，周围有组织细胞包裹；全黑处为导电胶。见图2～4。

图2 膝关节部位痛风石扫描电镜图像（A.50×；B.100×；C.500×）Fig 2 Scanning electron microscope image of tophi at the knee joint（A.50×；B.100×；C.500×）

2.3 痛风石能谱分析

2.3.1 膝关节部位痛风石所含化学元素定性分析

对图5A 进行能谱分析并生成特征谱线，可见该处痛风石由C、N、O、Na 及Cl 等元素组成，见图6A；对图5B 进行能谱分析并生成特征谱线，可见该处痛风石由C、N、O、Na 及Pt 等元素组成，见图6B。

图6 膝关节部位痛风石的扫描电镜能谱分析特征谱线Fig 6 Characteristic spectrum of the scanning electron microscopy energy spectrum analysis of tophi in the knee joint

2.3.2 膝关节部位痛风石所含化学元素定量分析

对图5A 进行定量分析，结果显示析出相中含有C、N、O、Na、Cl 等元素，各原子所占比例见表1；对图5B 进行定量分析，结果显示析出相中含有C、N、O、Na、Pt 等元素，Pt 元素则是由于对痛风石粉末样品喷金操作掺入，具体各原子所占比例见表2。由上述结果可知，痛风石中的化学元素以C、N、O、Na为主要，且上述元素均为其主要晶态成份C5H4N4O3Na 中的元素。

表1 膝关节部位痛风石图5A 的定量分析结果Tab 1 Quantitative analysis results of tophi in the knee joints shown in Figure 5A

表2 膝关节部位痛风石图5B 的定量分析结果Tab 2 Quantitative analysis results of tophi in the knee joints shown in Figure 5B

图3 肘关节部位痛风石扫描电镜图像（A.100×；B.200×；C.500×）Fig 3 Scanning electron microscope image of tophi at the elbow joint（A.100×；B.200×；C.500×）

图4 足关节部位痛风石扫描电镜图像（A.100×；B.200×；C.500×）Fig 4 Scanning electron microscope images of tophi in the foot joints（A.100×；B.200×；C.500×）

图5 膝关节部位痛风石扫描电镜图像（红色方框区域为扫描电镜能谱分析区域）Fig 5 Scanning electron microscopy image of tophi in the knee joint（the red box area is the analysis area of the scanning electron microscopy energy spectrum）

2.4 痛风石X 荧光分析

采用能量色散型X 射线荧光分析仪对痛风患者不同部位的痛风石的化学元素相对含量进行检测，因该仪器的检测范围为11Na～92U，故试样中原子序数小于11 的元素（如C、H、N、O 等元素）无法检出，本检测结果仅代表各元素的相对含量，而不是各元素在样品中的实际含量。见表3。

表3 不同部位痛风石的X 荧光分析结果（%）Tab 3 X-ray fluorescence analysis results of different parts of tophi（%）

2.5 痛风石X 射线衍射分析

应用X 射线衍射对痛风患者不同部位的痛风石晶体进行分析，发现痛风石的主要晶态成分为尿酸钠水合物或尿酸二氢钠水合物。在实验中，还观察到许多衍射强度较弱的非晶态衍射峰，说明还存在少量的非晶态成分，可能为碳酸钙或草酸钙等。见图7。

3 讨论

痛风最常影响足和踝关节，可导致足部及下肢的疼痛和残疾，严重影响患者的日常生活能力和生活水平［19-21］。痛风患者典型的影像学表现为边界清楚的偏心性骨质破坏，呈穿凿状或囊状，可见硬化边，骨质破坏边缘可见悬挂的骨质，呈外翘状突向痛风石，严重者可见多个骨质破坏区相互融合［22-25］。有研究发现，踝关节及膝关节韧带和肌腱处的痛风石多呈条块状，且邻近骨质呈弧形或波浪状破坏，周围软组织多肿胀［26-29］。痛风患者双能量CT 扫描结果发现尿酸盐沉积在关节内、骨表面和骨内时均伴有邻近骨皮质破坏，尿酸盐晶体沉积对骨侵蚀有不同程度的促进作用，可能导致软骨损伤，主要表现为抑制软骨细胞的活力和功能［30-34］。目前，对痛风的研究主要集中在降血尿酸的药物方面［18］，对痛风石本身的结构分析、成分性质等研究，国内罕有报道。

本研究通过H＆E 染色、扫描电镜、能谱分析、X荧光分析以及X 射线衍射等多种手段和方法，对痛风患者不同部位痛风石的微观结构及化学成分进行观察和分析，发现不同部位的痛风石均为不规则块状，呈圆形或椭圆形外貌；对痛风石所含化学元素的分析结果显示，其以C、N、O、Na、Cl 等元素为主，且上述元素均为其主要晶态成份尿酸钠水合物（C5H3N4NaO3）和尿酸二氢钠水合物（C5H2N4Na2O3）中的元素。另外，在检测中，发现痛风石中还存在少量的非晶态成份，且在X 射线荧光分析中发现有Ca、K、S、P、Fe、Zn、Cu 等多种元素存在，提示痛风石在形成过程中也会促进其他易沉淀物质的附着。据此，可以推测痛风石中可能同时存在碳酸钙或草酸钙等钙盐类物质，后续还需更精确地检测来确定，进而通过痛风石的成分来寻找能够有效溶解痛风石的方法。本研究为揭示尿酸盐诱导炎症反应机制的研究奠定了基础，为临床上进一步治疗痛风性关节炎提供了理论支撑，为改善痛风患者的生存质量提供了可能。

作者贡献度说明：

通讯作者为实验设计者，另外负责论文的审校与形式把关，第一作者、第二作者和第三作者为实验实施者，撰写论文由第一作者负责，第四作者进行实验评估，第五作者进行了免疫组化分析，第六作者进行了电镜分析，第七作者负责处理数据。