翁连解毒汤对溃疡性结肠炎大鼠血清IL-18、TNF-α 及结肠组织MUC2 表达的影响

陆玉婷，安桂叶，张晓艳，杨 倩，霍永利，李佃贵

（1.河北中医学院，河北 石家庄 050000；2.河北中医学院第一附属医院脾胃病科，河北 石家庄 050000）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种炎症性肠道疾病，临床以慢性起病、迁延不愈、易反复发作为特点，被世界卫生组织列为现代难治性疾病［1］。大部分患者临床症状表现为腹痛、腹泻以及黏液脓血便，西方国家此病发病率高。据流行病学统计，我国UC 的发病率及患病率也呈逐年升高的趋势。当前西医治疗UC 以氨基水杨酸类药物及类固醇激素为主［2］，但是存在着副作用大、复发率高等缺点。我国传统中医学在UC 的诊疗中发挥了其独特的优势，国医大师李佃贵教授总结50 余年的经验，逐渐确立浊毒学说［3］，认为浊毒为UC 发病的启动因子，以浊毒内蕴证为其主要病机［4］，自拟翁连解毒汤方治疗UC，前期研究表明其临床疗效显著［5］。免疫因素在UC 的发病机制中占有重要的位置，其中细胞因子、肿瘤坏死因子与UC 的发病有着重要的联系［6］。本研究旨在探讨翁连解毒汤对UC 大鼠血清白介素18（IL-18）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及结肠组织黏蛋白-2（MUC2）表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

购买河北医科大学动物中心清洁级Wistar 雄性大鼠60 只（动物合格证号：2008220），体质量（200±20）g。本实验所涉及的方案及操作流程已获得河北中医学院伦理委员会批准。

1.2 实验药物及制备

翁连解毒汤组成：黄连6 g，白头翁15 g，苦参6 g，蒲公英15 g，红景天、大血藤、白芍、防风、黄柏、秦皮、地榆、升麻、葛根、陈皮各12 g，茯苓15 g，炒白术6 g，薏苡仁20 g，炙甘草6 g。中药为配方免煎颗粒（广东一方制药有限公司）。用80 ℃无菌饮用水将配好的中药免煎颗粒搅拌溶解，按照人体与大鼠间体表面积等效剂量比值换算出高、中、低剂量组大鼠每公斤体重每天分别给药剂量为43.8、21.9、10.95 g，将相应剂量的免煎颗粒加入2 mL 的无菌饮用水稀释成混悬液，对应的浓度分别为5.92、2.96、1.48 g/mL，制备好药液放置于4 ℃冰箱保存。

美沙拉嗪肠溶片（惠迪，生产厂家为葵花药业集团佳木斯鹿灵制药有限公司，规格：0.25 g，批号：201222）。将药片研末过筛，按等效剂量比值给药剂量为0.36 g·kg-1·d-1），加入2 mL 无菌饮用水配成0.045 g/mL 浓度的药液，贴标签备注，放冰箱冷藏。

1.3 主要试剂与仪器

1.3.1 试剂盒 IL-18、TNF-α 定量酶联检测试剂盒（批号：20180319，上海森雄科技实业有限公司）；ABC 免疫组化试剂盒（PK-4000，Vector Laboratories，Inc.）；苏木素伊红（HE）染色试剂盒（编号：C0105，索来宝科技有限公司）；三硝基苯磺酸（批号：SL-BG2566V，美国sigma 公司）。

1.3.2 检测仪器 酶联免疫检测仪（MK3 FC，Thomer Fisher 公司）；显微图像分析系统（HMIAS-2000，武汉千屏影像技术有限责任公司）；凝胶成像系统（Leica DFC295，日本奥林巴斯公司）；高速冷冻离心机（1-15K，Thermo 公司）；石蜡切片机（德国Leica 公司）；光学显微镜［蔡司光学仪器（上海）公司］。

1.4 造模与分组

60 只大鼠随机分为空白组、模型组及中药高、中、低剂量组和美沙拉嗪组，共6 组，每组10 只，用三硝基苯磺酸（TNBS）-乙醇复合诱导UC 大鼠模型［7］，大鼠适应性喂养1 周，造模前记录大鼠的一般情况、体重、粪便性状及隐血情况，大鼠禁食（期间不禁水）24 h 后开始造模，造模开始前用乙醚对大鼠进行麻醉，麻醉完全后，根据TNBS 100 mg/kg 剂量，经肛门注入0.6 mL 的TNBS-乙醇溶液以灌肠，待结肠黏膜与混合液充分接触后将大鼠平放于笼内。同时空白组经肛门注入等体积的生理盐水，造模完毕后，等待大鼠苏醒，苏醒后全部大鼠恢复正常的饮食、饮水。造模3 d，可见到大鼠粪便性状的改变，出现稀便及脓血等，随机抽取2 只（模型组、中药高剂量组）处死，剖取结肠组织，观察结肠黏膜有充血水肿，溃疡形成，确认UC 模型建立成功。实验结束后，中药高、中剂量组及美沙拉嗪组各死亡1只，其中2 只因灌胃液误入气管所致，1 只死因不明。

1.5 动物给药

造模成功后，于第4 天开始灌胃给药，西药组予美沙拉嗪0.36 g/kg，翁连解毒汤低、中、高剂量组分别予10.95、21.9、43.8 g/kg，空白组、模型组给予等体积的生理盐水，每日灌胃1 次，均连续给药2 周。

1.6 标本采集及处理

末次给药后，禁食24 h，在此期间不禁水，所有大鼠经水合氯醛麻醉之后，迅速于右侧股动脉处取血4 mL，凝固后离心15 min，取其上清液标记后置于－20 ℃冰箱保存。脱颈处死大鼠，沿肠系膜纵轴剪开，留取肛门以上约8 cm 结肠组织，生理盐水冲洗肠道，滤纸吸干水分，肉眼观察后放入编码的40 g/L 的多聚甲醛固定液中密封避光，24 h 后切取病变处，进行石蜡包埋切片，常规HE 染色，封片，进行镜下观察。

1.7 指标检测

1.7.1 大鼠一般状况及疾病活动指数（Disease activity index，DAI）评分 观察各组大鼠的精神状态、皮毛情况（光泽度、密度）、饮食量、粪便性状及便血等情况，并做记录，同时测量每只每日大鼠的体质量。肛门消毒后采集粪便，采用邻甲苯胺法［8］测量粪便隐血情况。根据DAI 评分标准［9］进行评分，DAI＝（体质量下降分数+大便性状分数+便血分数）/3。见表1。

表1 大鼠DAI 评分标准Tab 1 Standard for evaluation of DAI in rats

1.7.2 镜下观察 大鼠结肠组织行常规HE 染色之后，光镜下观察结肠组织结构。

1.7.3 生化指标检测 依照试剂盒说明书规定的标准进行操作，IL-18 和TNF-α 血清含量用酶联免疫法检测，免疫组化法检测结肠组织中MUC2 的蛋白含量，在细胞测量模式下测其平均光度值。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠一般状况及DAI 评分

2.1.1 大鼠一般状况 空白组大鼠精力充沛，反应灵敏，饮食正常，体质量明显增加，毛发光泽，无稀便，便中无脓血、黏液。其余各组大鼠造模后，出现纳食量减少，体重减轻，静卧少动，精神差，大便不成形伴有脓血便等改变。药物灌胃后，各用药组开始出现活动增多，食欲好转，体质量增加，以中药高、中剂量组及美沙拉嗪组大鼠一般状况好转更为明显。模型组大鼠自造模后一般状况始终较差，精神萎靡，毛发黯淡，饮食减少，体质重下降，肛周污秽。

2.1.2 大鼠DAI 评分结果 与空白组比较，模型组及各给药组大鼠DAI 评分升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，中药低、中、高剂量组及美沙拉嗪组DAI 评分均有降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；中药高、中剂量组与美沙拉嗪组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；在给药组中，中药低剂量组DAI 评分最高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠DAI 评分比较（分，±s）Tab 2 Comparison of DAI scores of rats in each group（score，±s）

表2 各组大鼠DAI 评分比较（分，±s）Tab 2 Comparison of DAI scores of rats in each group（score，±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05;与模型组比较，△P＜0.05;与中药低剂量组比较，#P＜0.05。

DAI 评分0.00±0.00 3.28±0.49*1.56±0.44*△#1.59±0.52*△#2.81±0.44*△1.62±0.50*△#309.790＜0.05组别空白组模型组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组美沙拉嗪组n 10 999 10 9 FP

2.2 结肠组织病理观察结果

病理切片经HE 染色后，空白组大鼠可观察到结肠黏膜结构清晰，腺体、隐窝形态正常，排列规则，杯状细胞丰富，未见炎性细胞浸润。与空白组相比，模型组可见腺体遭到严重破坏，隐窝变形结构紊乱，杯状细胞大量丢失，黏膜层及黏膜下层可见浸润的炎性细胞。与模型组相比，中药高剂量组、中药中剂量组及美沙拉嗪组大鼠结肠黏膜得到修复和改善，腺体结构基本完整，炎性细胞浸润明显减少。中药低剂量组腺体黏膜结构略欠清晰，可见少量炎性细胞浸润。见图1A～F。

图1 各组结肠组织病理学变化（HE 染色，×200）Fig 1 Histopathological changes in each group（HE staining，×200）

2.3 生化指标检测结果

2.3.1 ELISA 检测结果 与空白组相比，模型组IL-18、TNF-α 含量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，各给药组IL-18、TNF-α 含量均有降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中，中药高剂量组、中药中剂量组与美沙拉嗪组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），IL-18、TNF-α 含量均低于中药低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠IL-18、TNF-α 比较（pg/mL，±s）Tab 3 I Comparison of L-18 and TNF-αof rats in each group（pg/mL，±s）

表3 各组大鼠IL-18、TNF-α 比较（pg/mL，±s）Tab 3 I Comparison of L-18 and TNF-αof rats in each group（pg/mL，±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05;与模型组比较，△P＜0.05;与中药低剂量组比较，#P＜0.05。

TNF-α 13.70±2.23 20.51±4.25*14.69±4.43*△#14.86±5.37*△#16.13±3.18*△14.55±3.15*△#39.495＜0.05组别空白组模型组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组美沙拉嗪组n 10 999 10 9 FP IL-18 142.31±27.33 199.42±70.32*172.85±22.82*△#174.38±31.97*△#181.79±29.46*△173.15±23.50*△#14.546＜0.05

2.3.2 免疫组化检测结果 与空白组相比，模型组大鼠结肠上皮组织MUC2 表达水平明显减弱，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，各给药组MUC2 表达水平均有增强，差异有统计学意义（P＜0.05）；中药高剂量、中药中剂量组与美沙拉嗪组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），中药低剂量组MUC2 表达水平低于其余各给药组，阳性细胞分布范围低于其余各给药组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4、图2。

表4 各组大鼠MUC2 蛋白积分光密度的比较（±s）Tab 4 Comparison of integral optical density of MUC2 protein in each group of rats（±s）

表4 各组大鼠MUC2 蛋白积分光密度的比较（±s）Tab 4 Comparison of integral optical density of MUC2 protein in each group of rats（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05;与模型组比较，△P＜0.05;与中药低剂量组比较，#P＜0.05。

MUC2 20 853.12±842.16 8 469.28±1 035.49*16 996.39±868.28*△#16 895.16±869.39*△#14 369.25±907.35*△16 495.69±813.55*△#228.736＜0.05组别空白组模型组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组美沙拉嗪组n 10 999 10 9 FP

图2 翁连解毒汤对溃疡性结肠炎大鼠结肠上皮组织MUC2 蛋白表达的影响（×200）Fig 2 Effect of Wenglianjiedu decoction on expression of MUC2 protein in colonic epithelium of rats with ulcerative colitis（×200）

3 讨论

UC 是一种慢性、特发性肠道炎症疾病，由于UC 发病机制尚不完全明确，因此本病并无特效药治疗。现代医学治疗UC 以激素、氨基水杨酸制剂、免疫抑制剂为主。美沙拉嗪属氨基水杨酸类制剂，目前被广泛用于轻、中度UC 的治疗，虽疗效值得肯定，但存在着不良反应多、易反复等问题，降低了患者生活质量。中医药在治疗UC 的过程中具有多系统、多靶点的整体调节作用，在UC 患者的临床治疗过程中有其独特的优势，尤其中药复方制剂对于调整免疫、抗氧化、调节炎症因子等起着重要作用，能稳定病情，增强疗效［10］。

从古至今，各路医家对本病的认识不断完善，传统医学将本病归为“肠辟”、“滞下”、“肠风”、“痢疾”等范畴，早在《黄帝内经》中就有对“肠辟”的病因病机论述，书中认为“肠辟”的病因病机为“阴阳失和，邪气中阴”，本病的发病主要与饮食不当、情志失调、脾胃虚弱、血络肠络等相关［11］。现代医家国医大师李佃贵教授首创“浊毒”理论，从浊毒角度认识UC，认为浊毒内蕴为UC 的主要病机，病变部位在肠，主要损伤肠络［12］，其发展机理为感受外邪，或饮食不洁（不节）等因素作用于脾胃虚弱之体，脾胃运化无权，酿成湿热化生浊邪，胶结于肠腑，日久成毒，进而浊毒之邪损伤肠道脂膜血络，化腐成脓，内溃成疡［13］。根据数据统计，京津冀地区UC 中医证候分布主要以浊毒内蕴证为主［14］。翁连解毒汤基于浊毒内蕴的病机所创立，以化浊解毒、凉血止痢为治疗原则，方药组成为黄连、白头翁、苦参、蒲公英、红景天、大血藤、白芍、防风、黄柏、秦皮、地榆、升麻、葛根、陈皮、茯苓、炒白术、薏苡仁、炙甘草。黄连具有清热燥湿止泻之功，黄连中主要的化学成分小檗碱具有显著抗炎作用，使促炎细胞与抗炎细胞达到一种平衡状态，有研究表明小檗碱对结肠炎症状态有很好的治疗效果，在中国人群中的广泛使用也说明其具有很好的耐受性［15，16］。白头翁具有清热解毒，消痈散结之功效，擅祛毒愈疡。中药药理学研究显示，白头翁中的皂苷类成分具有调节促炎因子及TNF-α 的潜力，具有免疫调节作用，同时能抑制癌细胞的增殖，诱导其凋亡，因此对于反复迁延难愈的UC，能有效降低其癌变的风险［17，18］。苦参化浊解毒祛湿，黄柏尤善利下焦湿热，二者同用，共清肠道之湿热；茯苓、白术、薏苡仁共行渗除脾湿，健脾止泻之效；蒲公英、大血藤清热解毒活血，既清除大肠浊毒，又活血止痢；红景天活血化瘀，解毒止痛，使肠络瘀血得以消散，脾胃得以运化，浊毒无以蕴生；地榆清热凉血，收涩止血，与白头翁相配伍，涩中兼通，是治疗血痢的常用药对之一；秦皮微苦、微涩，性寒，清热涩肠止痢；葛根味辛升发，能升发清阳之气，鼓舞脾胃清阳之气，而奏止泻痢之功；防风作为风药，能行、能使、能引，白术祛湿止泻，白芍柔肝缓急止痛，需借助风药升浮，助生长之势，行化浊解毒之功；炙甘草调和诸药。诸药合用，共奏凉血止痢，化浊解毒之功。

UC 的发生是免疫紊乱、宿主易感等多种因素造成的结果，肠道持续存在的慢性炎症是其重要的特征。UC 发病的关键因素在于IL、TNF-α 等促炎细胞因子的大量释放［19］。IL-18、TNF-α 等是公认的促炎因子，在免疫应答中起着关键的调节作用。正常状态下，抗炎与促炎因子处于一种动态平衡的状态，如果IL-18、TNF 等促炎因子分泌增加，这种动态平衡被打破，机体则会启动免疫系统，导致促炎因子释放、抑制炎症细胞因子的凋亡，产生炎症和毒性反应，从而形成溃疡。中医药通过多靶点、多系统的整体调节，在维持其动态平衡起到重要的作用［5］。肠道黏膜层对于外来的抗原有防御作用，黏膜层中的MUC2 对肠道有直接的保护作用。MUC2 表达下降，黏膜屏障功能受到破坏，肠腔内抗原、内毒素则会诱发免疫反应，形成炎症［20］。

本研究结果显示，与模型组相比，中药各剂量组IL-18、TNF-α 分泌均有下降，MUC2 蛋白表达增加；中药高、中剂量组与美沙拉嗪组相差不大，中药低剂量组IL-18、TNF-α 在治疗组中含量最高，MUC2 蛋白表达最低。结果表明，翁连解毒汤不同用药剂量治疗UC 疗效不同，中药高、中剂量组疗效优于中药低剂量组，但中药高剂量组与中药中剂量组疗效差异无统计学意义（P＞0.05），说明当中药剂量达到一定的血药浓度时，翁连解毒汤的疗效不随剂量的增加而增强，以此为临床应用提供了依据。中药高、中剂量组与美沙拉嗪组疗效差异无统计学意义（P＞0.05），但大量临床试验表明，美沙拉嗪存在着明显的肝脏、肾脏、胃肠道等多个系统的不良反应，中药组具有复发率低、不良反应小等优点。

综上所述，翁连解毒汤能明显降低UC 模型大鼠IL-18、TNF-α 的含量，上调MUC2 的表达，抑制炎症因子的释放，保护肠黏膜，促进损伤黏膜的修复，在治疗UC 中发挥免疫调节及抗炎、抗氧化作用。但是本研究仍存在一定的局限性：（1）因受研究经费预算、时间、场地等因素影响，各实验组样本量较少，致本研究偏倚较大，后期研究中可扩大样本量以增强本研究的可信度；（2）本研究旨在探讨翁连解毒汤对于促炎因子IL-18、TNF-α 的作用机制，观察指标较少，后期研究中可增加抑炎因子等指标以更加全面明确翁连解毒汤的作用机制。

作者贡献度说明：

陆玉婷：动物实验的操作及数据分析，撰写论文；安桂叶：参与实验实施；张晓艳：数据整理与分析；杨倩：项目（中医药防治重大疑难疾病（溃疡性结肠炎））负责人；霍永利：科研设计，对文章进行审校；李佃贵：理论指导。

本文无利益冲突。