8个灵芝菌株农艺性状、产量及有效成分比较分析*

盛立柱，谢良明，叶晓菊，何建芬，廖加贵，文冬华，林火松

（1.龙泉市食药用菌产业办公室，浙江 龙泉 323700；2.龙泉市张良明菌种场，浙江 龙泉 323700；3.龙泉市丽佳食用菌菌棒专业合作社，浙江 龙泉 323700）

灵芝（Ganoderma lingzhi）俗称灵芝草、仙草、瑞草等[1]，隶属于真菌门（Mycobionta） 担子菌纲（Ba sidiomycetes） 多孔菌目 （Polyporales） 灵芝科（Ganodermataceae） 灵芝属（Ganoderma）。灵芝是著名的食（药）用真菌，药用历史已有2 000多年，因具有多种药用价值而被历代医药学家视为滋补壮体、扶正固本的神奇珍品[2]。

我国灵芝栽培主要有2种模式，一种是段木灵芝栽培，另一种是代料灵芝栽培，目前以段木栽培为主，产地主要有浙江、安徽、福建、东北、四川、贵州等地[3]。段木灵芝栽培需要消耗大量的木材，且生长周期较长，耗时耗力，栽培过程需要覆土，随着栽培年限的积累，土壤栽培环境不断变化，灵芝栽培出现连作障碍，因此段木灵芝栽培需要每2年更换一次栽培场地，无形中增加了生产成本。灵芝代料栽培主要分布在华北地区，其模式已经十分普遍，但总体上我国灵芝的代料栽培多数采用分散式、手工式栽培模式，各地区生产水平不同，生产方式粗放，设施相对简陋，生产规模小，品质参差不齐，经济效益低[4]。

灵芝的药用价值来自其孢子粉，近年来研究表明灵芝的主要生理活性成分有灵芝多糖、三萜类化合物、蛋白质、多肽、核苷类、呋喃类、甾醇、生物碱和氨基酸等，而灵芝多糖和三萜类化合物是灵芝孢子粉的重要有效成分[5]，不同灵芝品种中灵芝多糖和三萜含量不同，相同品种在不同栽培基质中的灵芝多糖和三萜含量差异较大[6]。因此灵芝孢子粉的产量以及孢子粉中多糖和三萜类化合物的含量成为评价灵芝品种优劣的重要指标[7]。

随着大健康产业的不断发展，灵芝栽培技术的不断提升，以及对灵芝产品更深层次的开发利用，消费者对灵芝功效的认可度也逐渐提升，需求量日益增加。传统的分散式、手工式栽培模式已经无法满足市场的需求，故灵芝工厂化栽培是灵芝产业发展的新方向。灵芝工厂化栽培采用代料栽培模式，根据灵芝的适宜生长条件，采用数字化智能系统实时监测和调控栽培环境条件，大批量、多批次地生产灵芝。避免灵芝栽培受季节、环境因素的影响，解决重金属残留、灵芝栽培连作障碍等问题。合理利用森林资源，满足更大的市场需求，实现全年无间歇、高品质、高产能的灵芝生产。因此，通过试验筛选出适宜的灵芝代料栽培菌株品种，为灵芝工厂化栽培提供优势菌株。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：美芝、韩芝、日芝、角芝、泰山、113、X16、沪农1号共8个菌株，均来自龙泉市张良明菌种场。

菌袋：原种和栽培种菌袋为15 cm×29 cm×0.05 cm聚乙烯菌袋，生产菌袋为18 cm×42 cm×0.05 cm的聚乙烯菌袋。

PDA试管培养基配方：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉20 g，水定容至1 L。

原种和栽培种培养料配方：木屑80%、棉籽壳10%、麸皮8.5%、石膏粉1%、红糖0.5%，水60%～65%。

生产栽培配方：木屑88.5%、麸皮10%、石膏粉1%、红糖0.5%，水60%～65%，每袋干重0.7 kg～0.8 kg。

栽培场所：标准化钢架养菌大棚。

试验仪器：SE602FZH分析天平，奥豪斯国际贸易上海有限公司；UV1102Ⅱ759分光光度计，上海天美科学仪器有限公司；DK-S24电热水浴锅，上海森信试验仪器有限公司；JY92-IIN超声仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；VELOCITY 14R离心机，广州硕谱生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 母种的制备

制作PDA试管培养基50支，121℃高压灭菌30 min后制成试管斜面。随机抽取5支灭菌后的试管，放入恒温培养箱内25℃空培养48 h，观察试管是否有杂菌污染，未污染方可使用。每个供试菌株在无菌环境下各接种3支试管，标记好标签，放入恒温培养箱内25℃培养，随时观察菌丝体颜色变化情况，及时观察杂菌污染情况。待菌丝长到试管斜面2/3，转接原种。

1.2.2 原种的制备

将配制好的原种培养料装入原种菌袋内，封口后121℃高压灭菌，待温度升至121℃后保温2.5 h，冷却降温至约28℃进行接种。挑选菌丝体洁白浓密的母种试管，每支供试菌株的母种试管分别挑取直径为0.5 cm的菌块，分别接种到4个原种菌袋，标记好标签，于25℃室内层架培养，待原种长满菌袋后，方可接种栽培种。

1.2.3 栽培种的制备

将配制好的栽培种培养料装入栽培种菌袋内，封口后于121℃高压灭菌，待温度升至121℃后保温2.5 h。冷却降温至约28℃后在无菌环境下接种，每个原种菌袋约可接种40个栽培种菌袋。每个供试菌株接种12个栽培种菌袋，标记好标签，后放置于培养室内层架培养并观察栽培种菌丝生长状态，随时取出污染的栽培种菌袋。

1.2.4 生产菌包的制备

将配制好的生产栽培配方装入生产菌袋内，于121℃高压灭菌，待温度升至121℃后保温2.5 h，冷却降温至约28℃后可接种。每袋栽培种约可接种40个生产菌袋，每个菌株设计3个试验重复，每个重复90袋，标记好标签，放置于培养室内层架培养，温度控制在22℃～25℃，湿度控制在60%～65%。

1.2.5 菌丝生长状态和菌包成活率统计

每天观察一次菌丝生长状态，随时剔除污染菌包。记录每个菌株菌丝生长情况、发菌天数、成活率等。

1.2.6 出芝管理及试验数据采集记录

栽培场所提前用生石灰消毒，大棚顶部用次氯酸钠消毒，并通风晾晒3 d，将发满菌的生产菌包放置于标准钢架大棚内，每个供试菌株的生产菌包分区块放置，并做好试验标记。出芝过程进行光照、水分、通风、降温等管理，每天早、晚各喷水1次，高温时不喷水。子实体原基形成后，及时进行疏蕾，每袋保留生长力较强的1个原基。

子实体分化期要保持空气湿度在80%～85%，加强通风管理。灵芝菌盖边缘的白色消失，开始套筒收集孢子粉，孢子粉收集结束的依据是菌盖背面颜色变深，则收集孢子粉结束，记录采收时长并取下套筒，将孢子粉统一回收至干净的器具内。同时观察记录各菌株农艺性状、高温烂棒率，并记录各个菌株孢子粉及子实体产量。选取孢子粉产量较高的菌株，进行孢子粉中灵芝多糖和三萜含量的测定，做好数据统计。

1.2.7 灵芝三萜和多糖含量的测定

灵芝孢子粉用乙醇加热回流并超声破壁，采用齐墩果酸作为对照品，经香草醛-高氯酸溶液显色后做全波长测定，以此计算样品中三萜含量。具体试验步骤如下。

精密称取烘干的样品0.5 g，用95%的乙醇浸泡所有样品并定容至50 mL，超声提取2 h，期间经常摇动，于离心机中4 000 r·min-1离心10 min，取上清液备用。精密吸取齐墩果酸标准溶液0、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL 于各 10 mL 具塞试管中，加5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.5 mL，混匀后加塞，置60℃水浴恒温加热20 min，取出后迅速冷却，再加入5 mL的冰醋酸，混匀后于550 nm处测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标，齐墩果酸质量为横坐标作图，得标准曲线。精密吸取样品溶液1.0 mL置于试管中，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL及高氯酸1.2 mL后，按照齐墩果酸对照品溶液处理方法处理，于550 nm处测定吸光度值。灵芝三萜含量（W，%）的计算公式如下：

式中：c为从标准曲线上查得样品分解的三萜含量（μg）；v1为样品定容体积（mL）；m为样品的质量（g）；v2为比色测定时所移取试样分解液的体积 （mL）。

粗多糖采用SN/T 1676-2008食用菌中粗多糖含量的测定[8]中的方法测定。

1.3 数据分析

每个菌株设置3个试验重复，结果以平均值±标准差表示，试验数据用SPSS软件进行数据分析，采用ANOVA单因子方差分析，P＜0.05作为评判显著性标准。

2 结果与分析

2.1 菌丝生长速度和农艺性状

8个供试菌株的菌丝长势和农艺性状见表1。

表1 8个灵芝菌株生长情况Tab.1 Growth situation of eight strains of Ganoderma lingzhi

从表1可以看出，8个灵芝菌株菌丝长势均较强，其中日芝和韩芝菌丝长势比其他几个菌株菌丝长势稍弱，其他6个菌株菌丝长势均强。

8个菌株菌丝体形态特征均呈现出菌丝洁白、浓密，生长较快。比较菌丝满袋天数发现，美芝的菌丝生长速度最快，50 d长满菌袋，其次为沪农1号、113、X16、角芝、泰山，60 d长满菌袋，日芝、韩芝菌丝生长速度最慢，65 d长满菌袋。8个菌株接种成活率较高，均为99%以上。8个供试菌株中日芝和泰山覆土栽培后高温烂棒率较高，分别为15%和10%；韩芝、美芝烂棒率最低为2%；其余菌株（角芝、113、X16、沪农1号） 高温烂棒率为5%。8个菌株现蕾时间不一，美芝排场后现蕾最快，9 d开始现蕾；沪农1号和X16需12 d现蕾；角芝13 d现蕾；泰山15 d现蕾，日芝、韩芝和113需17 d现蕾。排场后待菌盖边缘黄色褪去，即套筒准备采收灵芝孢子粉，美芝开始产粉所需时间最短，排场后30 d即开始产粉；角芝排场后37 d开始产粉；韩芝排场后43 d开始产粉；泰山排场后47 d开始产粉；113排场后48 d开始产粉；X16和日芝排场后49 d开始产粉；沪农1号开始产粉所需时间最长，排场后51 d开始产粉。韩芝采收时长最长，从开始采收到采收结束需40 d，113菌株采收孢子粉33 d，其余6个育粉菌株采收孢子粉均需30 d。

8个灵芝菌株子实体的菌盖直径与菌柄长度记录见表2。

表2 8个灵芝菌株子实体农艺性状Tab.2 Agronomic characters of fruit bodies of eight strains of Ganoderma lingzhi

从表2中可知，8个供试菌株菌盖直径从大到小依次为：美芝＞韩芝＞X16＞角芝≈沪农1号＞泰山＞113≈日芝；8个菌株菌盖直径差异均不显著，菌盖直径为11.54 cm～13.53 cm，美芝菌盖直径最大，113、日芝菌盖直径最小。8个供试菌株中菌柄长度依次为：沪农1号＞113＞X16＞角芝＞日芝＞韩芝＞泰山＞美芝；其中沪农1号菌柄长度最长，与113、X16菌柄平均长度差异不显著，与角芝、日芝、韩芝、泰山、美芝差异显著；美芝菌柄长度最短，与韩芝、泰山菌柄平均长度差异不显著，与沪农1号、113、X16、角芝、日芝差异显著。记录子实体形态特征发现，113朵形偏小，沪农1号朵形均匀，日芝朵形欠圆且大小不均，其余菌株朵形均圆整；8个菌株只有美芝菌盖颜色正面呈红褐色，背面呈灰色，其余7个菌株均菌盖颜色正面呈褐色，背面呈淡黄色。

2.2 孢子粉和子实体平均产量

按90袋菌袋的总量计，8个供试灵芝菌株的孢子粉和子实体平均产量见表3。

表3 8个灵芝菌株孢子粉和子实体平均产量Tab.3 Average yield of spore powder and fruit body of eight strains of Ganoderma lingzhi

由表3可知，供试的8个菌株中，孢子粉平均产量从高到低依次是：美芝＞角芝＞沪农1号＞X16＞113＞韩芝＞泰山＞日芝。其中美芝孢子粉平均产量最高，与角芝、沪农1号、X16、113差异不显著，与韩芝、泰山、日芝差异显著，日芝孢子粉平均产量最低，与泰山差异不显著，与其他菌株差异显著；韩芝与其他7个菌株孢子粉产量差异均显著。子实体平均产量从高到低依次为：韩芝＞日芝＞泰山＞113＞X16＞沪农1号＞角芝＞美芝。其中韩芝子实体平均产量最高，与美芝子实体平均产量差异显著，与其他6个菌株子实体平均产量差异不显著；美芝子实体平均产量最低，与其他7个菌株子实体平均产量均差异显著。

2.3 三萜和多糖含量

对8个灵芝菌株的孢子粉三萜含量和多糖含量进行检测，结果见表4。

表4 8个灵芝菌株孢子粉活性成分Tab.4 Active ingredient in spore powder of Ganoderma lingzhi

从表4可知，孢子粉中三萜含量由高到低依次为：沪农1号＞113≈美芝＞X16＞韩芝＞泰山＞角芝≈日芝。其中沪农1号孢子粉中三萜含量最高，与113、美芝、X16、韩芝差异不显著，与泰山、角芝日芝差异显著；角芝和日芝孢子粉中三萜含量最低，角芝与日芝、X16、韩芝和泰山间差异不显著，与沪农1号、美芝差异显著；日芝与X16、韩芝、泰山、角芝差异不显著，与沪农1号、113和美芝差异显著。孢子粉中多糖含量从高到低依次为：113＞沪农1号＞美芝＞韩芝＞X16＞角芝≈日芝＞泰山。其中113孢子粉多糖含量最高，与其他7个菌株孢子粉中多糖含量差异显著；其次是沪农1号，与美芝、韩芝、X16孢子粉中多糖含量差异不显著，与角芝、日芝、泰山、113差异显著；泰山孢子粉中多糖含量最低，与X16、角芝、日芝差异不显著，与113、沪农1号、美芝、韩芝差异显著。

3 讨论

目前科研工作者主要是用农艺性状或采用分子标记法和同工酶的方法来筛选和评价菌株[9-10]，而分子标记和同工酶的分子化学方法比较费时[11]。因此试验观察了8个灵芝菌株的菌丝长势及菌丝体形态特征，量化了多个灵芝菌株的农艺性状，对其孢子粉和子实体产量进行统计分析，并进一步对孢子粉中的三萜和灵芝多糖进行了含量测定。从试验结果中可以总结出美芝的菌丝生长速度最快、高温烂棒率低、现蕾及产粉时间短，从下田排场到孢子粉采收结束仅需要69 d，比其他育粉灵芝菌株中最快的角芝快11 d，比最慢的韩芝快31 d，美芝作为工厂化育粉灵芝菌株，其生产周期占绝对优势，且孢子粉中三萜和多糖含量均仅次于沪农1号和113。角芝菌丝生长速度、高温烂棒率以及从现蕾到孢子粉采收结束时间仅次于美芝，比美芝慢11 d，孢子粉产量也仅次于美芝。

从各菌株的子实体产量结果分析中可以看出，孢子粉产量低的菌株子实体产量均较高，相反孢子粉产量高的角芝、美芝子实体产量均较低，辅助证明这2个菌株的生物转化率较高。因此，美芝和角芝均符合工厂化生产对菌株生产周期短、产量高、品质优的条件要求。沪农1号和菌株113，虽然从现蕾到孢子粉采收时间均在90 d以上，但沪农1号孢子粉中三萜含量最高，除与美芝的孢子粉三萜含量差异不显著外，与其余菌株均有显著差异，113孢子粉中多糖含量最高，且与其他菌株的差异均显著，因此沪农1号和菌株113也可作为工厂化育粉灵芝栽培备选菌株。

工厂化灵芝栽培，具有不与人争粮、不与粮争地、不与地争肥、不与农争时、不与其他行业争资源的优势，且栽培环境清洁，全程采用标准化管理，数字化操作，可避免孢子粉及子实体中农药残留及重金属污染，提高灵芝生产质量安全，实现灵芝标准化生产。工厂化灵芝栽培除可弥补棚式代料栽培的不足之外，选用杂木屑作为培养料，可减少森林资源的过度消耗，维持生态环境健康可持续发展。

通过农艺性状结合孢子粉和子实体产量以及孢子粉中的主要活性成分的分析，为灵芝工厂化栽培筛选出较适合菌株，为未来的灵芝产业向工厂化、现代化、高标准、高品质、健康绿色发展提供优良菌株。但对筛选出的育粉灵芝优势菌株，在工厂化更精准的控温养菌、控温出芝等条件下农艺性状以及孢子粉中三萜和灵芝多糖含量是否会有进一步提升，还需探索研究。