脑胶质瘤中MAGE-D4和CORO1C mRNA表达水平及其临床意义

张 沅， 张鹏博， 谢 欢， 韦 兴， 李 枫， 刘 畅， 沈 宁， 王燕靖， 农蔚霞， 张庆梅

脑胶质瘤是常见的颅内恶性肿瘤。近年来，尽管手术辅以放疗和化疗的传统治疗方法取得了较大进展，但脑胶质瘤患者的预后并未得到明显改善。因此，探究脑胶质瘤的病理分子机制，为开展新的脑胶质瘤辅助治疗奠定基础尤其重要。黑色素瘤相关抗原(melanoma-associated antigen,MAGE)是一拥有多个成员的大家族，因其许多成员在多种肿瘤组织中高表达，而在除睾丸和胎盘以外的正常组织中不表达或低表达，故被视为肿瘤分子靶向治疗的理想靶点。MAGE-D4是2001年Sasaki等采用基因表达系列分析技术鉴定出的一个MAGE家族成员，起初命名为MAGE-E1，后来发现其基因组结构及染色体定位与MAGE-D1非常相似，因此被归入MAGE-D亚家族，并改名为MAGE-D4。研究显示，MAGE-D4不表达或极低表达于正常脑组织，但高表达于脑胶质瘤，且沉默MAGE-D4表达可抑制脑胶质瘤细胞的恶性生物学行为，而过表达MAGE-D4则起到促进作用。为进一步了解MAGE-D4对脑胶质瘤恶性生物学行为的影响及其分子机制，本课题组前期通过RNA-seq高通量测序发现沉默MAGE-D4表达可抑制肌动蛋白结合蛋白CORO1C的表达。鉴此，本研究旨在通过基因表达谱交互式分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA)数据库、逆转录-定量聚合酶链反应(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)和小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)技术相结合的方式进一步探讨MAGE-D4与CORO1C的关联性及其临床意义，为脑胶质瘤分子靶向治疗的靶点筛选提供参考。

1 资料与方法

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GEPIA数据库资料GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)是一个整合了癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)和基因型-组织表达(Genotype-Tissue Expression，GTEx)项目的基因表达谱数据的公共数据库。本研究采用单基因分析方法，输入“MAGE-D4”或“CORO1C”后，选择低级别脑胶质瘤(low-grade glioma，LGG)和胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)这两种脑胶质瘤类型，其中LGG 518例，GBM 163例。另选择正常脑组织样本数据207例作为对照。

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组织标本和临床资料 选择2008年1月至2018年12月广西医科大学第一附属医院神经外科经手术切取的组织标本73例，其中脑胶质瘤62例，正常脑组织11例。脑胶质瘤经病理检查确诊。患者中男35例，女27例，年龄2～78岁，中位年龄40岁；病理类型包括星形细胞瘤41例，GBM 12例，少突胶质细胞瘤5例和室管膜瘤4例；根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)分级方法，Ⅰ～Ⅱ级(LGG)36例，Ⅲ～Ⅳ级(高级别脑胶质瘤)26例。所有脑胶质瘤患者在手术前未接受放射和化学治疗。正常脑组织来源于颅脑外伤行内减压手术患者。标本离体后迅速置液氮速冻，然后转移至-80 ℃低温冰箱保存备检。以MAGE-D4和CORO1C mRNA表达水平的中位数将其分为高表达组和低表达组。以上所有组织标本的收集均经患者知情同意，本研究获广西医科大学伦理委员会批准(编号：20200040)。

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细胞实验

1.3.1 细胞培养 人脑胶质瘤细胞株U87 MG和U251购自中国医学科学院上海细胞库。以DMEM培养基(Gibco公司)、10%胎牛血清(Gibco公司)配制完全培养基，培养箱(New Brunswick公司)条件设置为37 ℃，5% CO。

1.3.2 转染 于转染前24 h，将细胞以3×10cells/孔接种于6孔板，置于培养箱中培养，待细胞融合度达到70%左右时，更换新鲜无血清培养基，加入Lipo3000转染试剂(Invitrogen公司)与siRNA的转染复合物，孵育6 h后更换新鲜完全培养基，继续培养48 h后收集细胞，进行干扰效率确认及后续检测实验。siRNA由吉玛基因股份有限公司合成，MAGE-D4特异性siRNA(MAGE-D4 siRNA)序列与阴性对照序列(不含MAGE-D4相关序列)见表1。

表1 siRNA序列

名 称序列(5'-3')MAGE-D4 siR-NASense:GUGCAAUCGGAAAGCUACATTAntisense:UGUAGCUUUCCGAUUGCACGC阴性对照Sense:UUCUCCGAACGUGUCACGUTTAntisense:ACGUGACACGUUCGGAGAATT

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RT-qPCR法检测MAGE-D4和CORO1C mRNA的表达水平 应用细胞/组织总RNA提取试剂盒(Vazyme公司)提取组织标本和脑胶质瘤细胞株的总RNA，严格按照试剂盒说明书进行操作。应用超微量分光光度计(天根生化科技有限公司)检测所提RNA的浓度和纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。确定RNA无降解后，应用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR试剂盒(Vazyme公司)将RNA逆转录为cDNA。应用LightCycler480II荧光定量PCR仪(Roche公司)进行RT-qPCR，每个样品作3个复孔。反应体系：SYBR Green I Master 10 μl，ddHO 7.2 μl，上、下游引物各0.4 μl，cDNA 2 μl。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。参考相关文献设计引物，其序列见表2。以GAPDH为内参，采用2法计算MAGE-D4和CORO1C的相对表达量。

表2 RT-qPCR引物序列

基因名上游序列下游序列MAGE-D45'-CCAGAATCAGAACCGAGA-3'5'-CCAAAATCTCCGTCCTCA-3'CORO1C 5'-TCCTCCCTCTGCACAAGACT-3'5'-GGATCTGCCATACCATGACC-3'GAPDH 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'

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统计学方法 应用SPSS26.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用成组

t

检验；多组间比较采用单因素方差分析，以SNK检验进行组间两两比较。计数资料以例数(百分率)[

n

(%)]表示，组间比较采用

χ

检验。采用Pearson相关分析探讨MAGE-D4与CORO1C mRNA表达水平的相关性。

P

<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

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脑胶质瘤组织中MAGE-D4和CORO1C mRNA的表达情况 基于GEPIA数据库数据的分析结果显示，GBM、LGG组织中MAGE-D4和CORO1C mRNA的表达水平均高于正常脑组织，差异有统计学意义(

P

<0.05)。见图1。针对临床样本的RT-qPCR检测结果也显示，脑胶质瘤组织中MAGE-D4和CORO1C mRNA的表达水平高于正常脑组织，差异有统计学意义(

P

<0.05)，其表达水平分别是正常脑组织的3.038倍和3.713倍。见图2。

经单因素方差分析，*P<0.05

图2 脑胶质瘤组织与正常脑组织MAGE-D4和CORO1C mRNA表达水平比较图

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MAGE-D4和CORO1C表达水平与脑胶质瘤患者临床指标的关联性分析结果 MAGE-D4及CORO1C mRNA的表达水平与患者年龄、性别、WHO分级、病理类型、卡氏评分(Karnofsky performance score,KPS)、肿瘤最长径，以及Ki-67、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、S-100和波形蛋白(Vimentin)的表达水平均无关联性(

P

>0.05)。见表3，4。

表3 MAGE-D4表达水平与脑胶质瘤患者临床指标的关联性分析结果[(%)]

组 别例数性别年龄(岁)WHO分级病理类型男女<40≥40Ⅰ～Ⅱ级Ⅲ～Ⅳ级星型细胞瘤GBM少突胶质细胞瘤室管膜瘤高表达组3117(54.84)14(45.16)16(51.61)15(48.39)22(70.97)9(29.03)25(80.64)4(12.90)1(3.23) 1(3.23)低表达组3118(58.06)13(41.94)15(48.39)16(51.61)15(48.39)16(51.61)16(51.61)8(25.81)4(12.90)3(9.68)χ2-1.550.0653.2845.824P-0.7980.7990.0700.117组 别例数KPS(分)肿瘤最长径(cm)Ki-67#(%)GFAP#S-100#Vimentin#<70≥70<5≥5<10≥10低表达高表达低表达高表达低表达高表达高表达组3114(45.16)17(54.84)12(38.71)19(61.29)14(56.00)11(44.00)21(84.00)4(16.00)19(95.00)1(5.00) 18(85.71)3(14.29)低表达组3117(54.84)14(45.16)16(51.61)15(48.39)10(43.48)13(56.52)24(88.89)3(11.11)20(86.96)3(13.04)22(100.00)0(0.00)χ2-0.5811.0420.751---P-0.4460.3070.3860.698*0.610*0.108*

注：部分患者缺失Ki-67、GFAP、S-100、Vimentin指标的检查结果数据，不纳入分析；GFAP、S-100和Vimentin以(-)和(+)作为低表达，(++)和(+++)作为高表达；为Fisher′s确切概率法所得值

表4 CORO1C表达水平与脑胶质瘤患者临床指标的关联性分析结果[(%)]

组 别例数性别年龄(岁)WHO分级病理类型男女<40≥40Ⅰ～Ⅱ级Ⅲ～Ⅳ级星型细胞瘤GBM少突胶质细胞瘤室管膜瘤高表达组3119(61.29)12(38.71)18(58.06)13(41.94)22(70.97)9(29.03)23(74.20)4(12.90)2(6.45)2(6.45)低表达组3116(51.61)15(48.39)13(41.94)18(58.06)15(48.39)16(51.61)18(58.06)8(25.81)3(9.68)2(6.45)χ2-0.5901.6133.2842.280P-0.4420.2040.0700.527*组 别例数KPS(分)肿瘤最长径(cm)Ki-67#(%)GFAP#S-100#Vimentin#<70≥70<5≥5<10≥10低表达高表达低表达高表达低表达高表达高表达组3115(48.39)16(51.61)14(45.16)17(54.84)15(57.69)11(42.31)22(88.00)3(12.00)19(90.48)2(9.52)21(91.30)2(8.70)低表达组3116(51.61)15(48.39)14(45.16)17(54.84)9(40.91)13(59.09)23(85.19)4(14.81)20(90.91)2(9.09)19(95.00)1(5.00)χ2-0.0650.5811.3430.081--P-0.7990.4460.2470.7761.000*1.000*

注：部分患者缺失Ki-67、GFAP、S-100、Vimentin指标的检查结果数据，不纳入分析；GFAP、S-100和Vimentin以(-)和(+)作为低表达，(++)和(+++)作为高表达；为Fisher′s确切概率法所得值

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脑胶质瘤组织MAGE-D4与CORO1C mRNA表达水平的相关性分析结果 Pearson相关分析结果显示，临床脑胶质瘤样本组织中MAGE-D4与CORO1C mRNA表达水平呈正相关(

r

=0.848，

P

=0.000)。

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4

沉默脑胶质瘤细胞株MAGE-D4表达对CORO1C表达的影响 细胞实验结果显示，经MAGE-D4 siRNA沉默后，U87 MG和U251细胞CORO1C mRNA的表达水平显著下降(

P

<0.05)。见图3。

图3 沉默脑胶质瘤细胞株MAGE-D4表达后CORO1C的表达情况图

3 讨论

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目前临床上对脑胶质瘤的治疗仍采用手术辅以放射和化学治疗为主，但由于脑胶质瘤呈浸润性生长，与周围正常组织无明确边界，手术难以完全切除肿瘤。虽然残余的肿瘤细胞可以通过术后放疗和化疗来清除，但由于血-脑屏障的阻隔、治疗特异性及耐药性等问题，其疗效不佳。因此，脑胶质瘤患者，尤其是恶性程度高的GBM患者预后较差，复发率也较高。肿瘤分子靶向治疗是其中一种正在发展中的新辅助治疗方法，但开展肿瘤分子靶向治疗需要筛选肿瘤特异性分子。

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MAGE家族是目前研究较深入的一类肿瘤相关抗原分子，其许多成员被认为是肿瘤生物治疗的理想靶抗原。目前其一些成员如MAGE-A1和MAGE-A3已应用于临床试验，在一些颅外肿瘤辅助治疗中显示出较好的疗效。然而，由于脑胶质瘤中MAGE-A等的表达率远低于非神经系统的肿瘤，这严重制约了MAGE-A等分子在脑胶质瘤分子靶向治疗中的应用。MAGE-D4是从GBM中鉴定出的一个MAGE成员，有研究显示，MAGE-D4在许多肿瘤中特异性高表达。在本研究中，GEPIA数据库分析及临床样本验证结果均显示MAGE-D4在脑胶质瘤特异性高表达，这与相关研究报道结果相似。此外，关于MAGE-D4的生物学功能，有文献报道显示，MAGE-D4的表达水平与脑胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性生物学行为呈正关联，这提示MAGE-D4属于脑胶质瘤特异性分子，在脑胶质瘤的发生、发展过程中发挥重要作用，具有成为脑胶质瘤分子靶向治疗靶点的潜力。

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肿瘤的发生、发展涉及多分子的参与及相互作用，为了寻找与MAGE-D4相互作用的分子，本研究团队前期对MAGE-D4沉默的脑胶质瘤细胞进行RNA-seq高通量筛选，发现MAGE-D4沉默后下调的差异表达基因功能主要与肌动蛋白、微丝和细胞骨架的结合相关，且MAGE-D4沉默后，CORO1C表达明显下调。目前已知CORO1C是哺乳动物七种冠蛋白中被报道与肿瘤关系最为密切的一种分子，其可与F-肌动蛋白结合、交联，以直接或间接的方式调控细胞骨架的动态重塑，而细胞骨架的重塑与肿瘤细胞的迁移和侵袭等恶性运动行为密切相关。目前已有文献证实CORO1C在多种肿瘤中异常高表达，且与肿瘤的恶性表型和进展相关。本研究结果显示CORO1C在脑胶质瘤中呈高表达，与Thal等报道的结果相似。有研究显示，CORO1C表达与弥漫性脑胶质瘤的恶性程度相关，高级别脑胶质瘤中CORO1C呈强阳性表达，而LGG中CORO1C呈弱阳性表达。此外，CORO1C也可通过调控细胞骨架影响GBM的增殖、迁移、侵袭性伪足形成及基质金属蛋白酶分泌。以上结果提示CORO1C在脑胶质瘤的发生、发展过程中发挥重要作用。

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本研究结果显示，脑胶质瘤组织中MAGE-D4 mRNA和CORO1C mRNA表达水平呈正相关，且经沉默脑胶质瘤细胞株MAGE-D4的表达后，CORO1C表达也随之下调，提示MAGE-D4与CORO1C之间存在相互作用，其可能共同影响了脑胶质瘤的发生、发展。可能是研究病例数较少且临床资料不够完善的缘故，本研究未发现MAGE-D4和CORO1C的表达水平与脑胶质瘤患者的临床病理特征存在关联。这有待通过加大样本量进行前瞻性观察研究以进一步验证其二者与临床病理及患者预后的关系。

综上所述，脑胶质瘤中MAGE-D4和CORO1C mRNA均呈高表达，且二者表达水平呈正相关，其可能共同参与了脑胶质瘤的发生、发展。但具体的分子作用机制仍需进一步探讨，从蛋白相互作用和竞争性内源RNA分子机制等方面展开研究。