斑点追踪超声心动图联合血浆miR-30a评估急性冠状动脉综合征患者近期预后的临床研究

赵 娟， 柴仁杰， 宋势波， 卢丽萍， 潘 伟

急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)治疗的主要目标是改善ACS患者的预后。除了积极重建冠状动脉血运、强化降低低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、规范抗血小板治疗、使用β受体阻滞剂和肾素-血管紧张素系统(renin angiotensin system,RAS)拮抗剂之外，对ACS合并心力衰竭的早期识别和及时严格规范干预也是改善ACS患者预后的重要策略之一。既往研究表明，斑点追踪超声心动图(speckle-tracking echocardiography，STE)检查能显示早期心功能受损情况，但目前尚未在ACS诊治中普及应用[1-2]。另也有研究显示，miR-30a水平检测对评估心功能受损情况具有较好的临床意义[3]。鉴此，本研究旨在探讨STE联合miR-30a评估ACS近期预后的应用价值，现报道如下。

1 对象与方法

1.1研究对象 选择2020年1月至2020年12月在华南理工大学附属第六医院接受治疗的ACS患者，均对病变冠脉行完全血运重建。排除：心尖四腔、二腔及三腔切面上任一切面有两个心肌节段STE跟踪不理想者；入院时已存在非本次住院所致心力衰竭、左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)<50%者；男性左心室舒张末期(left ventricular end diastolic dimension，LVDd)内径>55 mm或女性LVDd>50 mm者；近期有感染或正在应用抗生素治疗者；合并严重的肝肾功能、恶性肿瘤或自身免疫性疾病患者。本次研究共入选252例。根据患者起病1个月后发生心衰、卒中和死亡的情况将研究对象分为预后良好组(199例)和预后不良组(53例)。

1.2检测方法与观察指标

1.2.1 STE检查 应用GE Vivid E9型彩色多普勒超声诊断仪(配备4V全容积探头)进行STE、LVEF检测。所有被检者取左侧卧位，同步连接心电图。启用4V心脏容积探头，患者深呼气后屏气，在三个心尖标准切面上测量。测量时要选取最佳的图像质量，并将左心室短切的可能性降至最低。进行全容积图像采集，选取最大的帧频(且帧频大于心率×40%)，连续存储4个心动周期心尖四腔心全容积动态图像，存盘并脱机分析。应用EchoPAC临床工作站软件进行图像分析：在心尖四腔心、心尖三腔心及心尖二腔心切面上于左心室舒张末期和收缩末期手动选取二尖瓣环中点和心尖处心内膜一点，软件将自动勾勒出心内膜和心外膜界线，效果不满意时可以手动调整，获得收缩期峰值左心室整体纵向应变(left ventricular global longitudinal strain，LV-GLS)并记录。系统自动追踪感兴趣区回声斑点，生成整体及节段纵向分层应变牛眼图。在收缩期和舒张期取心尖四腔和二腔切面应用双平面Simpson法测得LVEF。

1.2.2 miR-30a指标测定 所有研究对象于入院次日采空腹血，应用EDTA抗凝管收集3 ml全血，室温放置1～2 h。以1 600 g、4 ℃条件离心15 min，获取上层的血浆，-80 ℃备检。检测时取静脉血300 μl血浆，加入1.2 ml TRIzol® LS Reagent溶液(15596-026，美国Invitrogen)，并另加入2 μl人工合成的cel-miR-39(1 nM)作为外参，迅速震荡摇匀30 s，再加入200 μl氯仿，强烈震荡20 s后静置3 min。室温14 000 g离心10 min，将上层水层移至另一个新的EP管。加入10 μl SiO2吸附液，混匀，14 000 g离心5 min。吸弃上清，加入75%乙醇400 μl，14 000 g离心5 min。吸弃上清，风干5 min，获取总RNA。逆转录：取总RNA 10 μl加入25 μl DEPC H2O，85 ℃孵育5 min，立即置于冰上。加入dNTP 2 μl、RNase inhibitor 0.5 μl、miR-30a逆转录引物0.5 μl、cel-miR-39逆转录引物0.5 μl、5×buffer 5.0 μl、M-MLV 1.0 μl，混匀后42 ℃孵育60 min，随后85 ℃孵育10 min。逆转录引物序列见表1。Real-time PCR：取cDNA 5.0 μl(经1∶20稀释)、FR 0.5 μl、PR 0.5 μl、SYBR Green PCR Master Mix 10 μl(日本TOYOBO，QPK201)、H2O 4.0 μl，混匀，应用美国ABI7500荧光定量PCR仪进行扩增。采用2-△△Ct法计算相对表达量。

表1 引物序列

1.2.3 其他生化指标的检测 于患者入院次日采空腹血，应用OLYMPUS AU400全自动生化分析仪检测血糖、LDL-C、肌酐(creatinine，Cre)。

2 结果

2.1两组一般临床资料比较 两组年龄、性别、收缩压、舒张压、空腹血糖、LDL-C、Cre等临床资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 两组一般临床资料比较

2.2两组LV-GLS和LVEF值比较 预后良好组LV-GLS值低于预后不良组，差异有统计学意义(P<0.05)，但两组LVEF值比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 两组LV-GLS和LVEF值比较

2.3两组血浆miR-30a水平比较 预后良好组血浆miR-30a相对表达量为(10.74±1.23)，预后不良组为(12.42±1.88)，两组比较差异有统计学意义(t=7.778，P=0.000)。

2.4ACS患者LV-GLS与血浆miR-30a水平的相关性分析结果 Pearson相关分析结果显示，ACS患者LV-GLS与血浆miR-30a水平呈正相关(r=0.418，P=0.000)。

2.5影响ACS患者近期预后的多因素logistic回归分析结果 以LV-GLS和血浆miR-30a作为自变量，ACS患者近期预后为因变量(预后不良=1，预后良好=0)进行多因素logistic回归分析，结果显示，较高水平的LV-GLS和血浆miR-30a是促进ACS近期预后不良的危险因素(P<0.05)。见表4。

表4 影响ACS患者近期预后的多因素logistic回归分析结果

2.6LV-GLS、血浆miR-30a指标评估ACS患者近期预后的ROC曲线分析结果 ROC曲线分析结果显示，LV-GLS、血浆miR-30a指标具有评估ACS患者近期预后的应用价值(P<0.05)，且联合两个指标可提高评估效能。见表5，图1。

表5 ROC曲线分析结果

图1 LV-GLS、miR-30a及LV-GLS联合miR-30a评估ACS患者近期预后的ROC曲线图

3 讨论

3.1LVEF是评估心力衰竭的一个重要的指标，与预后关系密切[4-5]。根据LVEF水平，心力衰竭可分为射血分数下降的心衰(heart failure with reduced ejection fraction,HFrEF;LVEF<40%)，射血分数中间值的心衰(heart failure with midrange ejection fraction,HFmrEF;LVEF 40%～49%)和射血分数保留的心衰(heart failure with preserved ejection fraction,HFpEF;LVEF≥50%)[6]。LVEF下降往往伴随着心脏重构显著[7-8]，而在心脏重构早期，LVEF不一定发生变化[9-10]。心脏重构显著且LVEF下降者大多存在心力衰竭的症状。临床上，LVEF≥40%者不一定存在心力衰竭的症状，称之为亚临床左心室功能减退，这部分人群LVEF相对正常且无临床症状，经常被临床医师忽视。而部分ACS患者中也存在LVEF相对正常且无心力衰竭症状的情况。有研究显示，ACS患者合并亚临床左心室功能减退时，其预后更差[11]。若能早期识别这类亚临床左心室功能减退的ACS患者，可对其治疗策略提供更积极的指导。

3.2随着超声心动图技术的发展，多普勒组织成像(Doppler tissue imaging，DTI)、STE和实时三维超声心动图(real-time three dimensional echocardiography,RT-3DE)被应用于评估心脏功能。对左心室整体收缩功能评估的常用指标有LVEF、每搏输出量(stroke volume，SV)、二尖瓣环收缩期峰值速度(S′)、LV-GLS和左心室短轴缩短率(left ventricular fraction shortening，LVFS)[12]，其可对HFrEF进行评估，但对亚临床左心室功能减退的评估效能不理想。STE技术可对目标心肌组织的斑点回声进行追踪，获取心肌运动的纵向应变、圆周应变、径向应变、面积应变及其相应应变率等做功参数，从而计算出心肌各节段的机械变形量，定量评估心肌运动的长短轴、圆周运动及扭转与解扭转运动，通过识别心肌组织的生理和机械性变形评估心肌整体和局部的机械变形功能。STE常用评估亚临床左心室功能减退的参数有LV-GLS、左心室整体环向应变(left ventricular global circumferential strain,LV-GCS)、右心室游离壁纵向应变(right ventricular free wall longitudinal strain，RV-FWLS)。有研究显示，STE获取的LV-GLS是评估亚临床左心室功能减退的较理想指标[13]。本研究结果显示，对于LVEF≥50%的亚临床左心室功能减退的ACS患者，预后不良组LV-GLS受损较预后良好组更明显。

3.3miRNA是一类在生物进化过程中高度保守的非编码微小RNA，通过降解目的mRNA或抑制其翻译，调节目的基因表达，进而影响细胞或生物个体的生理、病理状态[14-15]。近年来，对miR-30的研究涉及广泛。目前报道的人类和褐家鼠miR-30家族有miR-30a、miR-30b、miR-30c-1、miR-30c-2、miR-30d和miR-30e六个亚型。每个亚型均能生成5p和3p两个片段，其中miR-30c-1与miR-30c-2的5p片段相同。自噬是真核细胞蛋白降解的重要途径，其作用主要是清除降解细胞内受损伤的细胞结构、衰老的细胞器以及不再需要的生物大分子等，同时也为细胞内细胞器的构建提供原料，即细胞结构的再循环[16-17]。自噬是真核细胞生长、分化、执行功能及死亡的重要调控机制，与肿瘤、退行性疾病等疾病相关[18-19]。本课题组的前期研究显示心肌组织miR-30a下调可通过调节心脏自噬而调节心肌重构，外周血浆miR-30a水平反映心肌重构状态[20-21]。本研究结果显示，对于LVEF≥50%的亚临床左心室功能减退的ACS患者，近期预后不良组血浆miR-30a水平较预后良好组高，其水平与LV-GLS呈正相关，提示亚临床左心室功能减退的ACS患者已经存在早期心肌重构。多因素logistic回归分析结果显示较高水平的血浆miR-30a是促进ACS患者近期预后不良的危险因素。ROC分析结果显示LV-GLS联合血浆miR-30a具有评估ACS患者近期预后的应用价值，值得临床参考。

综上所述，STE和血浆miR-30a可应用于评估ACS患者近期预后，有利于对ACS患者提供早期危险分层信息，指导临床治疗，且其检测方法简易，值得临床推广。