八桂止痛膏对小鼠镇痛 抗炎作用效果实验研究

赵丽娟， 张艳菊， 张诚昊， 廖承成

刘复兴教授是云南省中医医院的国家级名老中医，长期从事中医皮肤病临床工作。八桂止痛膏(原名消炎止痛散；Bagui Analgesic Ointment，BAO)是刘复兴教授治疗带状疱疹及带状疱疹后神经痛的自拟方，对带状疱疹及带状疱疹后神经痛有良好的疗效[1-2]。该方具有活血化瘀、通络止痛之功效，在临床应用中对多种疼痛性疾病有较好的疗效，止痛迅速，疗效显著，不良反应较少，安全性较高，已在我院皮肤科应用多年[3]。本研究旨在从动物实验角度探讨该药方镇痛及抗炎效果。

1 材料与方法

1.1实验动物 昆明种雌性小鼠共120只，体重18～22 g，无特定病原体(specific pathogen free，SPF)，购自北京华阜康生物科技股份有限公司[许可证号：SCXK(京)2014-0004]。实验前适应性饲养1周，自由进食和饮水，饲养环境符合SPF级要求。

1.2试剂与仪器 桂皮醛标准品(中国食品药品检定研究院，批号：110710-201821)；甲醇(分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司)；石油醚(分析纯，成都市科隆化学品有限公司)；75%乙醇(昆明远方制品生物有限公司)；生理盐水(昆明南疆制药有限公司)。双氯芬酸二乙胺乳胶剂[扶他林，规格：20 g∶0.2 g(以双氯芬酸钠计)，批号：国药准字H19990291，北京诺华制药有限公司]；冰醋酸(天津博迪化工股份有限公司)；PL6001-L天平[海特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；YLS-6B智能热板仪(济南益延科技发展有限公司)。

1.3实验药物 八桂止痛膏。(1)药物组成：桂枝、透骨草、三棱、莪术、八角枫、昆明山海棠、大黄等量。(2)制作方法：①粉碎：按处方称取桂枝、莪术、大黄3味药材，分拣过筛，除去泥沙等杂质，粉碎成粗粉，备用。②提取：按处方称取三棱、八角枫、透骨草、昆明山海棠4味中药，煎煮2次：第1次加10倍量的水，煎煮1 h；第2次加8倍量的水，煎煮40 min，过滤。合并2次滤液，减压浓缩至1.20 g/ml(80 ℃)，备用。③干燥：将提取的浸膏与上述粗粉搅拌均匀，55 ℃充分干燥，粉碎成细粉(过100目筛)，备用。④膏剂制备：将适量羊毛脂和凡士林混合，加热至熔融状态，搅拌均匀，趁热过滤，除去杂质，加热至80 ℃，加入上述中药细粉并不断搅拌，加入适量液体石蜡调节软膏剂的稀稠度，趁热分装，放冷即得，制成1 000 g。

1.4给药剂量[4]在实验前24 h用电动推剪进行小鼠腹部脱毛，脱毛范围约3 cm2。小鼠与人剂量的换算如下：(1.44×10 000 cm2×0.05 ml/cm2×0.003)÷67 cm2=0.03 ml/cm2。计算公式中，1.44×10 000 cm2为人(50 kg)的体表面积，0.05 ml/cm2为人体常用剂量[5]，0.003为小鼠与人按照体表面积折算的等效剂量换算系数，67 cm2为小鼠体表面积。故本实验小鼠用药剂量为0.03 g/cm2×3 cm2=0.09 g/次。

1.5实验方法与观察指标

1.5.1 热板实验[6]在室温22 ℃下，调节热板温度至(55±0.5)℃，将小鼠放在热板上，以开始出现舔后足行为所需时间(s)作为反应时间，将2次反应时间均值作为给药前基础痛阈值。其中凡舔后足时间<5 s或>30 s者弃之不用。选择合格小鼠24只，随机分为空白对照组(不予药物干预)，扶他林组(予以双氯芬酸二乙胺乳胶剂，0.09 g/只)，BAO组(予以BAO，0.09 g/只)，每组8只。按照上述分组，将相应剂量的药膏均匀涂擦于小鼠腹部，2次/d，连续给药3 d。在末次给药后15 min、30 min、45 min放置于热板上，记录其反应时间作为给药后痛阈值。给药后，若反应有>60 s者，以60 s计算。

1.5.2 醋酸扭体实验[7-8]取小鼠24只随机分为空白对照组(不予药物干预)，扶他林组(予以双氯芬酸二乙胺乳胶剂，0.09 g/只)，BAO组(予以BAO，0.09 g/只)，每组8只。按照上述分组的相应剂量将药膏均匀涂擦于小鼠腹部，2次/d，连续给药3 d。在末次给药1 h后，每只小鼠腹腔注射0.6%冰醋酸溶液0.1 ml/10 g，记录15 min内小鼠因疼痛产生的扭体次数，以腹部内凹、躯干与后肢伸展、臀部抬高等为扭体反应。扭体次数抑制率(%)=(空白对照组扭体均数-给药干预组扭体均数)/空白对照组扭体均数×100%。

1.5.3 二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验[4，9]取小鼠24只，随机将其分为空白对照组(不予药物处理)，扶他林组(予以双氯芬酸二乙胺乳胶剂，给药剂量：0.18 g)，BAO组(予以BAO，给药剂量为：0.03 ml/cm2×2×3 cm2=0.18 ml)，每组8只。在首次给药前，用剃毛器给小鼠腹部脱毛，脱毛面积大约为3 cm2。用分析天平、单道移液器分别称取各分组药量，将药物均匀涂抹于小鼠腹部脱毛处皮肤上，用塑料薄膜覆盖，后用胶布固定纱布，每次药物接触至少4 h/次，每天给药1次，连续给药3 d。在末次给药30 min后，用50 μl 100%二甲苯溶液涂擦小鼠左耳廓(两面都要涂擦)。4 h后将小鼠断颈处死，沿耳廓边限剪下左右耳，用6 mm直径打孔器分别在左右耳同一位置打下圆耳片，称重。两耳片质量差=(左耳重量-右耳重量)，记为耳廓肿胀质量。

2 结果

2.1三组不同时间点痛阈值比较 在给药后15～45 min，扶他林组小鼠痛阈值呈逐渐上升趋势，而BAO组小鼠痛阈值呈先上升后下降趋势。在给药后45 min时间点，BAO组小鼠痛阈值低于扶他林组，差异有统计学意义(P<0.05)。两组给药后各时间点的痛阈值均高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 三组不同时间点痛阈值比较

2.2三组扭体次数及扭体次数抑制率比较 扶他林组和BAO组扭体次数低于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。扶他林组和BAO组扭体次数和扭体次数抑制率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 三组扭体次数及扭体次数抑制率比较

2.3三组小鼠耳廓肿胀质量比较 扶他林组耳廓肿胀质量小于BAO组和空白对照组，且BAO组耳廓肿胀质量亦小于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 三组小鼠耳廓肿胀质量比较

3 讨论

3.1BAO具有活血化瘀、通络止痛之功效，常用于治疗带状疱疹后神经痛，对多种疼痛性疾病，如关节型银屑病、类风湿性关节炎也具有较好的临床疗效。BAO由桂枝、透骨草、三棱、莪术、八角枫、昆明山海棠、大黄等组成。桂枝为本方君药，辛、甘、温，归心、肺、膀胱经，具有发汗解表、温通经络、助阳化气等功效，《长沙药解》有言“入肝胆而散遏抑，极止痛楚，通经络而开闭塞，甚去寒湿”，可治疗寒凝血滞诸痛证、风湿痹证。现代药理学研究表明，桂枝挥发油具有显著的抗炎作用，具有解热、镇痛、抗炎等作用[10]。透骨草性温，味辛、甘，归肝、肾经，具祛风除湿、舒筋活络、活血止痛、解毒化疹之功效，加强桂枝温通经络的作用。秦洪琼等[11]研究也证实，透骨草具有抗炎、镇痛的效果。大黄其性寒，味苦，归脾、胃、大肠、肝、心经，具泻下攻积、清热泻火、止血、解毒、活血祛瘀之功效，与透骨草同为臣药。研究表明大黄具有抗病毒、抗炎等药理作用[12]。三棱性平，味苦、辛；莪术性温，味辛、苦，同归肝、脾经，具破血行气、消积止痛之功效。前人王好古有言：“三棱，破血中之气，肝经血分药也。三棱、莪术治积块疮硬者，乃坚者削也”。莪术主要含有姜黄素、莪术醇、莪术二酮等有效成分，具有抗炎镇痛、抗肿瘤、抗血栓形成、消除自由基等作用[13]。八角枫，其性温，味辛、苦，归心、肝经，具祛风除湿、舒筋活络、散瘀止痛之功效。八角枫须根煎剂腹腔注射可使小鼠的痛阈升高，用药部位以须根部位效用最强。万照宇等[14]验证了复方七叶莲液(含有八角枫须根)对小鼠局部炎症的影响，结果显示，复方七叶莲液可以抑制二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀，降低组胺所致的小鼠皮肤毛细血管通透性增加。也有研究表明，八角枫具有镇痛、消炎、抗风湿及肌肉松弛作用[15]。昆明山海棠性微温，味辛、苦，大毒，归肝、脾、肾经，具祛风除湿、活血止血、舒筋接骨、解毒杀虫之功效，且具有抗炎免疫和免疫抑制作用[16]。八角枫祛风除湿、通络止痛；昆明山海棠祛风除湿、消肿止痛，二者共为使药，引药直达病所。全方具有破气行血、通络止痛的作用。BAO组方体现了血温则行，气行则血行，通则不痛之法则。从现代药理研究看，其具有抗炎、镇痛作用。

3.2带状疱疹病毒性神经痛主要是由于病毒感染导致神经局部发生炎症、变性坏死从而引起疼痛，炎症、疼痛是治疗的重点，本实验主要通过疼痛和炎症缓解程度来判定BAO的临床疗效。本研究热板实验结果显示，扶他林和BAO均能提高小鼠痛阈值，且在干预30 min内扶他林和BAO的止痛效果相当。醋酸扭体法也是观察动物疼痛的实验方式之一，小鼠腹腔被注射醋酸后，脏器受到刺激，导致局部炎症反应，产生疼痛，小鼠则会表现出扭体的行为，其灵敏度高，广泛用于动物疼痛实验[17]。本研究结果显示，扶他林和BAO均能抑制小鼠的扭体反应，提示两者镇痛效果相近。二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验可用于观察药物的抗炎效果，本研究结果显示，扶他林和BAO均能有效抑制炎症，但BAO抗炎效果稍弱于扶他林。

综上所述，BAO具有活血化瘀、通络止痛之功效，具有良好的抗炎、止痛效果。但本研究尚未对BAO的副作用与扶他林软膏进行对比，将在以后的研究中进一步完善。