超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用检测饮用水中N-亚硝胺类消毒副产物

孙 铭，古其会，张菊梅，郭伟鹏，吴慧清，张友雄，韦献虎，吴清平,*

（1.中国科学院广州化学研究所，广东 广州 510650；2.广东省科学院微生物研究所，华南应用微生物国家重点实验室，广东省微生物安全与健康重点实验室，广东 广州 510070；3.中国科学院大学，北京 100049）

亚硝胺具有“三致”毒性，是水中一类新型含氮消毒副产物，近年来以N-亚硝基二甲胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）为主的N-亚硝胺类消毒副产物在世界各地的水环境中（饮用水厂、污水处理厂等）频繁检测出[1-4]。饮用水作为食品饮料工业的重要原料，其安全性直接关系着食品饮料行业的健康发展。因此，检测饮用水中痕量N-亚硝胺，对评价饮用水水质，保证食品饮料水源的安全具有重要意义。

饮用水中N-亚硝胺的含量通常较低，因此在检测前需要进行浓缩以降低方法检出限，提高灵敏度，常用的方法主要有液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）法[5]、固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）法[6]和固相萃取法[7-8]。其中，LLE需要大量有机溶剂，耗时费力。SPME虽然所需水样少，省时，但容易受到环境及操作条件的影响，而且对低挥发性的N-亚硝胺回收率和灵敏度较低，仅适用于废水中N-亚硝胺的检测[9]。而固相萃取能同时萃取多种不同性质低浓度的目标物质，可对大体积样品进行萃取，具有溶剂用量少，浓缩倍数高等优点[9]。此外，固相萃取还能克服LLE在复杂基质样品中易乳化的缺点[9]。

气相色谱-质谱联用[10-13]和气相色谱结合热能分析仪[14]已用于分析N-亚硝胺类物质，但主要用于分析挥发性和热稳定的N-亚硝胺[15-16]。采用带紫外荧光检测器的液相色谱和毛细管电泳方法检测N-亚硝胺也有报道，但灵敏度低，无法满足饮用水中痕量N-亚硝胺的检测需求[17]。已有文献报道[3,18-19]采用电喷雾电离源（electrospray ionization，ESI）的液相色谱-串联质谱方法能同时检测出饮用水中9种N-亚硝胺类消毒副产物，包括NDMA、亚硝基甲基乙胺（N-nitrosomethylethylamine，NMEA）、亚硝基二乙胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）、亚硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR）、亚硝基吗啡（N-nitrosomorpholine，NMOR）、亚硝基二丙胺（N-nitrosodi-n-propylamine，NDPA）、亚硝基哌啶（N-nitrosopiperidine，NPIP）、亚硝基二丁胺（N-nitrosodi-n-butylamine，NDBA）、亚硝基二苯胺（N-nitrosodiphenylamine，NDPhA）。但N-亚硝胺中的NDMA、NMEA和NDEA分子质量较小，ESI对于这3种物质的检测灵敏度相比于其他6 种偏低，具有一定的局限性。利用大气压化学电离（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）源对食品中小分子农药残留[20]和功能物质[21]的检测已取得显著效果，但在N-亚硝胺的液相色谱-质谱检测方法中鲜见采用APCI离子源进行分析[22]。

本实验采用固相萃取法对样品进行前处理，并考察流动相、洗脱剂及定容溶剂对9种N-亚硝胺类消毒副产物响应强度的影响。优化样品前处理及进样条件，采用APCI离子源，建立一种基于超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪同时检测饮用水中9种N-亚硝胺的方法。本实验通过检测实际水样中的痕量N-亚硝胺，验证该方法的适用性，对于评价饮用水水质，进一步研究去除和控制饮用水中N-亚硝胺，保证食品饮料生产中饮用水安全具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

CNW椰壳活性炭固相萃取小柱（2 g/6 mL） 上海安谱实验科技股份有限公司；SB-C18RRHD色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm） Agilent Technologies（上海）公司。

9种N-亚硝胺混标（2 000 mg/L甲醇溶液） 美国Supelco公司；NDMA-D6标准品（1 000 mg/L甲醇溶液）、NDPA-D14标准品（1 000 mg/L二氯甲烷溶液）美国O2si公司；二氯甲烷、甲醇、甲苯、乙腈、甲酸（均为色谱纯） Agilent Technologies（上海）公司；碳酸氢钠、乙酸铵、硫代硫酸钠、碳酸氢铵（均为分析纯）上海麦克林生化科技有限公司；高纯氮气（纯度＞99.9%）广州市君多气体有限公司；水为Milli-Q超纯水。

1.2 仪器与设备

ExionLC AD /Triple Quad 5500+QTRAP超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪 美国SCIEX公司；HSE-12D固相萃取装置（配真空泵） 天津市恒奥科技发展有限公司；MTN-2800D氮吹仪 天津奥特赛恩斯公司。

1.3 方法

1.3.1N-亚硝胺及内标标准溶液的配制

以甲醇为溶剂，采用购买的标准品梯度稀释得到9种N-亚硝胺及NDMA-D6的混合标准溶液，质量浓度依次为1、2、5、10、20、50、100 μg/L，另外，NDPA-D14作为定量内标，其质量浓度为20 μg/L。

1.3.2 实际水样的采集

取东江某水厂水源水及其供应区域内的管网水水样。针对管网水进行采集的过程中，将质量浓度为100 mg/L的硫代硫酸钠提前加入到棕色的采样瓶中，以脱去管网水中的余氯。采取的水样需在低温、避光条件下运回实验室，2 周内完成分析。

1.3.3 样品处理

采用固相萃取法对样本进行处理，在使用固相萃取小柱萃取之前，依次用6 mL二氯甲烷、12 mL甲醇和超纯水15 mL活化小柱。水样的pH值用碳酸氢钠将其调节至8.0左右，500 mL水样以3～5 mL/min的速率通过活化后的小柱。水样上样完后，在低压下抽60 min。最后，使用二氯甲烷3×5 mL完成洗脱，洗脱过程中的实际流速应控制在2～3 mL/min范围内，利用氮吹实现洗脱液的浓缩处理之后，向其中加入超纯水定容至0.5 mL，以备进样。

1.3.4 仪器检测

液相色谱条件：SB-C18RRHD色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相由含有0.2%甲酸的10 mmol/L碳酸氢铵溶液（流动相A）和甲醇（流动相B）组成，流速0.4 mL/min，进样量20 μL，柱温40 ℃。流动相梯度洗脱程序：0～0.5 min，85% A、15% B；0.5～2.5 min，85%～5% A、15%～95% B；2.5～3.5 min，5% A、95% B；3.5～3.51 min，5%～85% A、95%～15% B；3.51～6.0 min，85% A、15% B。

质谱条件：采用APCI正离子多反应监测模式检测。气帘气压力30 psi；离子化电流3 μA；离子源温度350 ℃；喷雾气压力40 psi。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

采用高质量浓度（1 mg/L）的混标溶液，进行质谱条件的优化，在全扫模式下确定待测物的母离子和最优去簇电压，然后在子离子模式下确定定量和定性子离子及对应的最优碰撞能量。优化得到9种N-亚硝胺及回收率标准物质（NDMA-D6）和定量内标（NDPA-D14）的质谱参数，结果如表1所示。

表1 9种N-亚硝胺及内标的质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters of nine N-nitrosamines and internal standard

2.2 流动相的选择

以含0.2%甲酸的10 mmol/L碳酸氢铵溶液和甲醇作为流动相时样品检测强度为100%，根据不同流动相条件下相对强度确定最佳流动相。如图1所示，当水-甲醇作为流动相时，NDMA、NMEA和NDEA的相对强度值小于50%，说明采用该流动相，NDMA、NMEA和NDEA的响应较差。同样，当采用0.2%甲酸-甲醇作为流动相时，NMEA、NPYR和NDEA的响应较差；采用含0.2%甲酸的10 mmol/L乙酸铵溶液和甲醇作为流动相时，NDMA、NMEA和NDBA的响应较差。因此，要保证9种N-亚硝胺都能够有较好的响应，在4 种流动相中甲醇和含有0.2%甲酸的10 mmol/L碳酸氢铵溶液作为流动相是最佳选择。

图1 流动相对9种N-亚硝胺相对强度的影响Fig. 1 Influence of mobile phase composition on relative intensities of nine nitrosamines

2.3 固相萃取材料的选择

已有报道[23]不经过浓缩预处理直接进样检测水中N-亚硝胺，但通常方法检出限为μg/L级别，而饮用水中N-亚硝胺质量浓度通常为ng/L级别，另外检测水源水时，直接进样会受到水体复杂基质的干扰，因此需要进行净化、浓缩后进样，才能满足实际饮用水的检测要求。固相萃取是常用于饮用水中N-亚硝胺的预浓缩方法，据文献[7,19,22]报道，相比其他填料（HLB、Ambersorb572）的固相萃取小柱，EPA521推荐的椰壳活性炭小柱保留效果较好，因此本实验选择椰壳活性炭作为固相萃取材料。

2.4 洗脱溶剂的选择

最终的洗脱溶剂应该充分结合被检测物质的实际回收率进行确定。实验分别使用二氯甲烷、甲醇和甲苯作为洗脱溶剂，测定其对9种N-亚硝胺的回收率影响，结果如图2所示。二氯甲烷对9种N-亚硝胺的回收率均较高，所以选择二氯甲烷作为本研究的洗脱剂。

图2 洗脱剂对9种N-亚硝胺回收率的影响Fig. 2 Influence of eluents on recoveries of nine nitrosamines

2.5 定容溶剂的选择

检测不同定容溶剂条件下9种N-亚硝胺的相对强度，结果如图3所示。当定容溶剂选择乙腈的情况下响应最差，甲醇和乙腈利于NDBA的响应，二氯甲烷利于NDPhA的响应，而超纯水作为定溶溶剂能够让其中绝大多数N-亚硝胺表现出较高的响应强度。因此，在本研究中选择超纯水作为最终定容溶剂。

图3 定容溶剂对9种N-亚硝胺相对强度的影响Fig. 3 Influence of reconstitution solvents on relative intensities of nine nitrosamines

2.6 实验方法评价

2.6.1 标准曲线绘制

采用内标法定量，结果如表2所示，9种N-亚硝胺及NDMA-D6在0～100 ng/L质量浓度范围内表现出良好线性关系，并且其相关系数在0.996 9～0.999 5之间。根据3 倍信噪比对应的质量浓度确定检出限，在0.10～0.33 ng/L之间。相关报道[7,24]采用ESI离子源进行液相色谱-质谱检测水中9种N-亚硝胺时，对其中NDMA、NDEA和NMEA这些分子质量较小的N-亚硝胺检出限较低，通常为ng/L，而相关报道[22]采用APCI离子源进行液相色谱-质谱检测N-亚硝胺时，这些分子质量较小的N-亚硝胺检出限也为1 ng/L，本实验中NDMA、NDEA和NMEA的检出限降低到0.15～0.33 ng/L，低于1 ng/L，相比之前报道的灵敏度更高，利于检出水中更低含量的N-亚硝胺。本实验采用的超高效液相色谱-串联质谱检测方法，与之前报道的气相色谱-串联质谱[25]和液相色谱-串联质谱[26]相比，具有检测时间短的优点，可以在6 min内同时检测水中9种N-亚硝胺。

表2 9种N-亚硝胺的线性方程及其检出限和定量限Table 2 Linear equations and limits of detection and quantification of nine N-nitrosamines

2.6.2 回收率和精密度的测定

9种N-亚硝胺在源水和管网水中分别加标10 ng/L和50 ng/L时的回收率结果见表3。除在加标质量浓度为10 ng/L时，NDPhA的回收率在70%以下，其余回收率均在70%～130%范围内，满足EPA521的要求，无明显基质效应。相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均不大于10%，精密度良好。说明本方法的适用性较好，可以满足实际水体中N-亚硝胺的检测要求。

表3 9种N-亚硝胺的加标回收率及RSDTable 3 Recoveries and relative standard deviations of nine N-nitrosamines in spiked samples

2.7 饮用水的检测

为了验证本方法对实际饮用水中9种N-亚硝胺的有效性和适用性，选择珠江支流东江某水厂水源水（S1～S7）及其供水区域内管网水（T1～T7）进行污染调查，测定水样中9种N-亚硝胺类化合物含量，结果如表4所示，9种N-亚硝胺类消毒副产物在源水（S4、S5和S6）3个水样和管网水（T2、T3、T4和T6）4个水样，共7个水样中检测出N-亚硝胺。共有5 种N-亚硝胺被检出，分别为NDMA、NDEA、NMOR、NDPA和NDBA，其中NDMA的被检出频率最高，每个被检出的水样中都含有NDMA，其质量浓度为0.6～5.4 ng/L，这与相关全国性调查结果[27-29]类似。被检出的N-亚硝胺中NDBA的质量浓度最高，Chen Yingjie等[30]在针对长江中下游流域开展调查的过程中也得出了相类似的结论。之前大部分研究主要集中于N-亚硝胺中的NDMA[31-34]，而忽视了除NDMA以外的N-亚硝胺的危害，根据调查的结果可知以后需对NDBA给予更多的关注。

表4 实际水样检测结果Table 4 Results of determination of nine N-nitrosamines in actual water samples ng/L

3 结 论

本研究采用固相萃取法进行前处理，以APCI为离子源，建立水中9种N-亚硝胺的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。与现有N-亚硝胺检测研究相比，本方法具有灵敏度高、检测速度快、适用性好的优点，能够满足饮用水中N-亚硝胺的检测需求。该方法的建立可以为系统性识别和评估食品饮料生产中N-亚硝胺的风险提供帮助。