二次接种时间对腊肉挥发性风味的影响

毛永强，贠建民，赵风云，艾对元，张紊玮，何 奎，王 睿，武淑娟

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070）

腊肉制品作为中国典型的发酵肉制品，以其醇厚、鲜美的风味，深受广大民众的喜爱。但在其生产过程中依然面临着生产周期长、加工难度大、安全稳定性差、风味难以调控等难题[1]。目前关于腊肉加工工艺改进和风味控制还缺乏系统研究。风味是腊肉制品整体可接受性中一个重要的感官方面，直接影响消费者的购买力[2]。挥发性风味物质作为风味的关键指标之一，对腊肉产品的开发和质量控制有着重要的意义。将人工培养微生物应用到发酵肉制品生产过程中可以减少有害物质的产生和积累，并且能产生促进蛋白质和脂肪分解的酶类，为产品风味的形成做出贡献[3]。

近年来，国内外针对功能微生物应用于发酵肉制品已进行了大量研究[4-7]，主要集中在探究功能微生物对肉制品安全性、抗氧化性和风味特性影响等方面。Zhang Qilin等[8]研究发现植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ZY-40可有效控制发酵鲢鱼香肠中的生物胺，提高产品的安全性。何健叶[9]使用乳杆菌和模仿葡萄球菌（Staphylococcus simulans）进行香肠发酵时发现，各项指标均优于不添加发酵剂的对照组，产品的风味、质构和色泽明显得到改善，且产品的货架期延长。冯美琴等[10]以植物乳杆菌CD101和模仿葡萄球菌NJ201作为混合发酵剂制作发酵香肠，发现接种该混合发酵剂制作发酵香肠能促进蛋白质降解产生更多具有抗氧化活性的多肽，从而有助于通过内源性抗氧化肽抑制发酵香肠的氧化。Chen Qian等[11]从哈尔滨干香肠中分离出4 株乳酸菌，探究其对猪肉肌浆蛋白提取物中蛋白质水解和风味形成的影响，发现4 株菌能利用肌浆蛋白产生风味物质，能产生可溶性肽和呈味游离氨基酸。

已经开发的肉用商业发酵剂有植物乳杆菌、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、木糖葡萄球菌（S. xylosus）、肉葡萄球菌（S. carnosus）、清酒乳杆菌（L. sakei）和汉逊德巴利酵母菌（Debaromyces hansenii）等[12-13]。它们都是通过产酸或者细菌素等提高肉制品的安全性，丰富肉制品的功能特性和风味特性[3]。目前的研究大多都采用单一菌株或者多种菌株直接复合的方式进行肉品接种发酵，而鲜有见将两种或多种微生物分阶段接种发酵的报道。

为此，本研究选用分离自传统陇西腊肉的产蛋白酶和脂肪酶的3 株优势细菌（木糖葡萄球菌、植物乳杆菌、肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides））为发酵剂，依据传统陇西腊肉制作过程中微生物群落演替规律[14]，以木糖葡萄球菌为前发酵剂，植物乳杆菌和肠膜明串珠菌复合为后发酵剂，模拟腊肉发酵工艺，分阶段接种于肉品中，探究二次接种时间对腊肉挥发性风味特性的影响，旨在为腊肉现代化生产提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料与菌种

五花肉购自北京华联超市。

木糖葡萄球菌MT、植物乳杆菌ZR、肠膜明串珠菌CM均分离自传统陇西腊肉。对菌株的产酸性、产蛋白酶和脂肪酶能力，以及耐盐性等进行了验证[15]，发现这些菌株在传统陇西腊肉制作过程中具备潜在的发酵优势。

1.1.2 试剂与培养基

2-辛醇（色谱纯）、正构烷烃（C8～C25） 美国Sigma-Aldrich公司；氯化钠（分析纯） 天津市光复科技发展有限公司。

MRS培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉浸粉8.0 g、酵母浸粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、柠檬酸氢二铵2.0 g、乙酸钠5.0 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.04 g、琼脂14.0 g、吐温80 1.0 mL、蒸馏水1 L，pH 6.5±0.2。

营养琼脂培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉3.0 g、氯化钠5.0 g、琼脂15.0 g、蒸馏水1 L，pH 7.3±0.1。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1FD超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；Ax10 Axio生物显微镜 德国蔡司公司；固相微萃取装置、50/30 μm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅萃取头 美国Surpelco公司；TRACE1310-ISQ气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用仪 法国Salleron公司。

1.3 方法

1.3.1 产蛋白酶和脂肪酶验证[16-17]

产蛋白酶验证培养基在营养琼脂培养基中加入1%的脱脂奶粉，37 ℃培养24 h，在菌落周围能产生洁净圈的即为高产蛋白酶的菌株。产脂肪酶验证培养基在营养琼脂培养基中加入1%的乳化橄榄油和0.1%罗丹明B，37 ℃培养48 h，在紫外线下拍照观察，能在培养基上出现明显的荧光圈，即被认为是高产脂肪酶的菌株。

1.3.2 发酵剂的复配及接种方案

李彦虎[14]对传统陇西腊肉制作过程中微生物群落演替规律研究发现，葡萄球菌属在陇西腊肉制作的发酵前期丰度最高，乳酸菌属在发酵后期丰度最高。因此，本实验选用木糖葡萄球菌作为前发酵剂（记为F-0），在第0天时添加；植物乳杆菌和肠膜明串珠菌（1∶1）复合作为后发酵剂，第1组（F-6）在发酵过程中的第6天时添加，第2组（F-10）在发酵过程中的第10天时添加，第3组（F-14）在发酵过程中的第14天时添加，并以不接种发酵剂的自然发酵组为对照（CK）。

1.3.3 发酵剂的活化与制备

木糖葡萄球菌在营养琼脂培养基上培养24 h，植物乳杆菌和肠膜明串珠菌在MRS培养基上48 h，分别活化3 次后，接种到相应的液体培养基上培养24～48 h，血球计数板计数，达到108CFU/mL以上即可，4 ℃、6 000 r/min离心10 min，弃去上清液，用无菌生理盐水洗涤3 次后重悬，菌悬液保留备用。

1.3.4 腊肉的制作

工艺流程：原料肉的选择→清洗杀菌→低温腌制→接种发酵→发酵成熟。

选择新鲜五花肉，切成长12～15 cm、宽5～7 cm的肉条，清洗干净，用紫外照射杀菌30 min，置于4 ℃冰箱备用。然后抹上食盐（用量为3%），在4 ℃冰柜腌制48 h。腌制完成后，将活化好的发酵剂菌悬液接种于腌制好的肉中（肉块按2 cm3等分，分别在每个等分方块中用注射器注射接种活化后的发酵剂种子液1 mL，肉块两端穿绳吊挂于框内，置于恒温恒湿培养箱（（15±1）℃、相对湿度80%），发酵20 d。除食盐外，本实验不添加任何香辛料。

1.3.5 挥发性风味物质分析

1.3.5.1 萃取条件

参照师希雄等[18]方法并作修改。准确称取5 g腊肉样品、2 g氯化钠于20 mL顶空瓶中压盖，温度70 ℃于水浴锅加热平衡10 min，然后将顶空萃取头插入玻璃瓶内。萃取时间为30 min，萃取完成后，于GC-MS进样口250 ℃解吸5 min。

1.3.5.2 GC条件

DB-WAX毛细管柱（60 m×250 μm，0.25 μm），起始温度40 ℃，保持1 min，以4 ℃/min的速率上升至220 ℃保持15 min；载气（He）流速1.0 mL/min。不分流进样。

1.3.5.3 MS条件

电子电离源：70 eV，离子源温度250 ℃，传输线温度180 ℃，扫描质量范围m/z50～350。

1.3.5.4 定性与定量

取正构烷烃混标（C8～C25）按照上述实验条件进行GC-MS分析，记录每个正构烷烃的保留时间，对质谱全离子扫描图谱所得的挥发性物质进行保留指数的计算，如式（1）所示。结合NIST质谱库按照正反匹配度大于700对所测得的挥发性物质进行定性分析。

式中：n和n+1分别为目标物出峰前后正构烷烃碳原子数；tn和tn+1分别为相应正构烷烃的保留时间；tx为未知物在气相色谱中的保留时间（tn＜tx＜tn+1）。

采用内标法进行半定量分析，内标是质量浓度为81.06 μg/mL二辛醇，挥发性物质含量按式（2）计算：

1.3.6 特征挥发性物质的评价

参照刘登勇等[19]的方法。样品中关键挥发性风味物质采用相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）分析法确定。在此之前，需要先确定对样品风味贡献最大的挥发性组分。鉴于此，本研究采用气味活度值（odor activity value，OAV）方法，即嗅感物质的绝对浓度与其感觉阈值之间的比值。规定对样品风味贡献最大的挥发性组分ROAVmax为100，其他挥发性组分ROAV按式（3）计算。对样品总体风味的贡献越大，挥发性组分的ROAV一般越大。

式中：Ci和Cmax分别为各挥发性组分和对样品总体风味贡献最大挥发性组分的相对含量/%；Ti和Tmax为各挥发组分和对样品总体风味贡献最大挥发性组分的感觉阈值/（μg/L）。

1.3.7 感官评价

参照孔晓雪等[20]方法并修改。选择10 位无饮食偏好的人员且经过专业训练，以此组成感官评价小组，分别将各样品置于蒸锅中蒸制（样品中心温度达到65～70 ℃后，维持30 min），切成厚度为0.5 cm的切片，分别以肉色、口感、气味、滋味、组织状态5 项指标对腊肉样品进行评定（评定室温度（20±2）℃，相对湿度60%～75%，白色灯光，配有换气装置），以此确定制作过程中感官品质的变化。评价标准如表1所示。

表1 感官评价标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of fermented dry-cured meat

1.4 数据处理

采用Microsoft Office Excel 2016对所得实验数据进行基本处理，使用IBM SPSS Statistics 20.0对实验数据进行显著性分析，利用Origin 2018进行主成分分析（principal component analysis，PCA），Heml 1.0.3.7软件进行热图分析，所得实验数据均以表示。

2 结果与分析

2.1 菌株产蛋白酶和脂肪酶验证实验

图1结果显示，在培养24～48 h后3 株菌均出现透明圈（图1A）和荧光圈（图1B），证明3 株菌均能产生蛋白水解酶和脂肪酶，具备潜在的肉类发酵能力。

图1 产蛋白酶（A）和产脂肪酶（B）验证结果Fig. 1 Identification of protease-producing ability (A) and lipase-producing ability (B)

2.2 不同处理组腊肉挥发性风味物质种类及含量的变化

利用固相微萃取-气相色谱-质谱（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）方法，从4个处理组（CK、F-6、F-10、F-14）中共鉴定出72 种挥发性风味物质，包括醛类15 种、酯类19种、醇类13种、酸类13种和其他类12 种。其中，CK组共检出醛类9种、酯类9种、醇类6 种、酸类6 种、其他类8 种；F-6组共检出醛类10 种、酯类16 种、醇类7 种、酸类8 种、其他类10 种；F-10组共检出醛类13种、酯类15 种、醇类10 种、酸类10 种、其他类9种；F-14组共检出醛类12 种、酯类11 种、醇类5 种、酸类6 种、其他类9种。如图2A所示，3 组处理组的挥发性风味物质种类均显著多于CK组（P＜0.05），其中，处理组F-10的挥发性风味物质种类最多，表明复合发酵剂在一定程度上能显著提高腊肉挥发性风味物质的种类，且在发酵中期二次接种发酵时，能使挥发性风味物质种类更丰富。由图2B所示，不同处理组的离子强度（峰高）在同一保留时间上不同，表明同一种挥发性物质在不同处理组中的含量不同；在同一处理组中，不同保留时间的离子强度（峰高）不同，表明不同的挥发性物质在同一处理上的含量也不同。

图2 不同处理组腊肉挥发性物质的种类（A）和总离子流图（B）Fig. 2 Composition (A) and total ion current chromatogram (B) of volatile compounds in naturally fermented and inoculated meat

2.2.1 醛类物质

醛类物质是由不饱和脂肪酸的氧化和氨基酸Strecker反应产生，能够反映脂肪氧化的程度[21]。醛类物质因具有很强的挥发性且阈值较低，对腊肉风味的贡献较大[22]，但较高含量也会对腊肉风味产生负面影响[23]。由表2所示，共检出15 种醛类物质，不同处理组之间种类差异明显，其中F-10组检出13种醛类化合物，显著多于其他组（P＜0.05），这表明，在发酵中期进行二次接种，能更有效地增强腊肉挥发性风味物质的种类，使风味更加丰富。醛类香气物质的含量在不同处理之间差异也很明显，其中CK组的醛类物质的总含量最高，为1 746.46 μg/kg，显著高于各二次接种组（P＜0.05），表明接种发酵剂具有一定的抗氧化能力，抑制了脂肪的氧化程度，这一结果与曹辰辰等[24]探究功能性发酵剂对发酵香肠氧化稳定性及挥发性风味物质影响的结果一致。

表2 不同处理组腊肉的醛类物质Table 2 Contents and aroma descriptions of aldehydes in naturally fermented and inoculated meat

2.2.2 酯类物质

研究表明，酯类物质对腊肉风味的主要贡献是水果味[25]，如丁酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、戊酸乙酯等都呈现水果香味，而这些物质主要是其对应的酸与醇类在微生物的作用下发生酯化反应产生[26-27]。由表3可知，不同处理组腊肉的酯类物质在种类和含量上差异都很明显（P＜0.05），且添加发酵剂组均显著高于CK组。本研究中，酯类物质含量最高的是己酸乙酯和辛酸乙酯，己酸乙酯具有强烈的酒香且有很强的持久力，而辛酸乙酯具有白兰地酒香味[22]，对腊肉的风味贡献较大，这两种酯类物质的含量在发酵中期（F-10）时显著高于其他组，说明在发酵中期进行二次接种更有利于丰富腊肉的风味。

表3 不同处理组腊肉的酯类物质Table 3 Contents and aroma descriptions of esters in naturally fermented and inoculated meat

2.2.3 醇类物质

如表4所示，本实验共检出13种醇类物质。研究证明[28]，醇类物质因其含量低，且阈值较高，所以对腊肉风味的贡献并不大，但也有部分醇类物质因阈值较低，已被证实对发酵肉制品的整体风味具有一定的贡献，如Marušić等[29]研究发现，1-辛烯-3-醇在火腿中含量较高，其呈现蘑菇味，是火腿中的重要挥发性风味物质。同样，在本实验中腊肉的醇类物质含量最高的也是1-辛烯-3-醇，该物质阈值较低，对腊肉的整体风味具有重要的贡献作用。李彦虎[14]探究传统陇西腊肉群落演替规律对风味变化的影响时发现，1-辛烯-3-醇与葡萄球菌具有较强的相关性，本实验检出的1-辛烯-3-醇含量在3个复合发酵组中显著高于CK组（P＜0.05），证明所添加的木糖葡萄球菌对腊肉风味形成发挥了一定的作用，并且3个复合发酵组腊肉中检出了具有香醋味的正戊醇，在CK组中并未检出，推测这可能是添加的发酵剂导致产生。在不同的复合发酵组中，F-10组腊肉的醇类物质在种类和含量上均显著高于其他组（P＜0.05），说明在发酵中期进行二次接种更有利于腊肉风味的形成。

表4 不同处理组腊肉的醇类物质Table 4 Contents and aroma descriptions of alcohols in naturally fermented and inoculated meat

2.2.4 酸类物质

酸类物质主要来源于脂肪降解和氧化[30]。如表5所示，本实验共检出13种酸类物质，主要为丁酸、正己酸、正癸酸和辛酸等。而这些化合物都有特殊的风味，如丁酸具有腐臭的酸味，正己酸具有不愉快的辛辣味，正癸酸具有不愉快的气味，辛酸具有腐臭味等[23]。这些可能是腊肉异味的主要贡献者。本研究中，CK组腊肉的酸类化合物含量整体高于3个复合发酵组，且差异显著（P＜0.05），表明添加复合发酵剂能有效控制腊肉异味的产生。比较3个复合发酵组腊肉的酸类物质，能够看出F-10组腊肉的酸类物质含量最低，证明在发酵中期进行二次接种能更有效降低腊肉不良风味的形成。

表5 不同处理组腊肉的酸类物质Table 5 Contents and aroma descriptions of organic acids in naturally fermented and inoculated meat

2.2.5 酮、酚和其他类物质

如表6所示，本研究共检出4 种酮类物质，主要是呈现蘑菇味的1-辛烯-3-酮和具有奶油香的2,3-辛二酮。其中2,3-辛二酮只在3个复合发酵组腊肉中均有检出，CK组腊肉中并未检出，而1-辛烯-3-酮的含量却在CK组腊肉中最高，可能是所添加的发酵剂使其转化为其他产物导致其含量降低。研究者认为，酮类物质主要来自于多不饱和脂肪酸的氧化，其作为中间产物也会转化为其他产物[31]，这可能也是造成本研究结果的主要原因。酚类是腌腊肉制品的典型风味成分，且阈值较低，对腊肉风味的形成及抗氧化有重要贡献[32]。本实验共检出3种酚类物质，其中，苯酚赋予腊肉酚香味，对甲酚赋予腊肉芳香味。在各处理组中，F-10组腊肉的酚类物质含量显著高于其他组（P＜0.05），达到91.20 μg/kg。本实验共检出5 种其他类物质，这些物质应阈值较高，且含量较低，对腊肉风味的形成影响不大，因此对腊肉香气的贡献可以忽略。但值得注意的是，具有青香、肉香味的2-戊基呋喃被认为是对腊肉风味具有贡献的风味物质[22]，而本实验只在CK组中检出了2-戊基呋喃，3个复合发酵组中并未检出，推测可能是微生物的作用使其前体物质转化为其他产物所致。

表6 不同处理组腊肉的酮、酚及其他类物质Table 6 Contents and aroma descriptions of ketones, phenols and other substances in naturally fermented and inoculated meat

2.2.6 热图分析

为进一步探讨不同二次接种时间下腊肉挥发性风味成分的特点，将表2～6的所有物质进行了热图分析（图3）。不同处理间各挥发性香气成分的含量差异显著，根据不同处理间的聚类分析可知，F-6和F-10两组处理聚在一起，说明在发酵前期和发酵中期进行二次接种所形成的香气成分比较接近，而后再跟F-14聚在一起，最后和CK组发生聚类，说明添加的复合发酵剂能有效改善腊肉的整体风味，对腊肉风味的形成具有重要贡献作用。

图3 不同处理组腊肉挥发性风味物质含量的热图Fig. 3 Heat map of the volatile flavor contents in naturally fermented and inoculated meat

2.3 不同处理组腊肉ROAV和PCA

2.3.1 ROAV分析

腊肉的挥发性化合物中，对香气起主要贡献作用的通常仅是一小部分化合物，而且这些成分对香气的贡献取决于其浓度与阈值，单方面通过含量评价挥发性风味化合物对腊肉风味的贡献不全面。为进一步探究不同二次接种时间对腊肉风味有重要贡献的主体挥发性化合物的影响，基于OAV法和ROAV法并结合挥发性物质感觉阈值对挥发性风味成分进行了筛选。如表7所示，ROAV在1～100之间的物质为CK组13种、F-6组14 种、F-10组20 种、F-14组18 种，ROAV在0.1～1之间的物质为CK组5 种、F-6组3种、F-10组4 种、F-14组4 种，远小于由质谱和保留指数法所确定的挥发性风味物质种类，说明大部分挥发性风味物质都没有气味特征，或其阈值较高，对腊肉的整体风味没有显著贡献。分析不同处理之间的ROAV发现，添加复合发酵剂的3 组ROAV大于1的物质种类明显多于CK组，这与由质谱和保留指数法所得结果一致，证明添加发酵剂能显著改善腊肉的整体风味特性。分析3 组添加发酵剂的腊肉ROAV发现，F-10组ROAV大于1的物质种类明显高于F-6组和F-14组，说明在发酵中期进行二次接种能更有效地丰富腊肉风味化合物。

表7 不同处理组腊肉关键风味物质Table 7 Key flavor compounds in naturally fermented and inoculated meat

2.3.2 PCA

PCA方法主要研究ROAV≥1的风味物质，结果如表8所示，PC1、PC2、PC3方差贡献率分别是70.43%、18.43%和6.93%，累计贡献率达95.79%，说明能够完全代表样品的主要信息特征。由图4A可知，F-6和F-10两组聚在同一象限，CK和F-14两组聚在同一象限，表明产生的风味物质相似，这一结果与热图聚类分析（图3）的结果一致。由图4B可知，F-10组独居一象限，与其他3 组明显分开，说明该组腊肉的风味成分与其他组差异显著，而该组的主要代表物质是A4（壬醛）、A8（(E,E)-2,4-癸二烯醛）、B2（己酸乙酯）和C2（1-辛烯-3-醇）。结合PC，可以良好区分不同二次接种时间下样品，为后期复合发酵剂的添加提供理论依据。

表8 PC特征值及方差贡献率Table 8 Eigenvalues of principal components and their contribution rates to total variance

图4 不同处理组腊肉挥发性风味物质的PCA载荷图Fig. 4 PCA loading plots of volatile flavor compounds in naturally fermented and inoculated meat

2.4 感官评价

如图5所示，对不同二次接种时间下的腊肉从肉色、组织形态、滋味、口感和气味5个方面进行感官分析，结果显示，3 组添加复合发酵剂的腊肉评分整体高于CK组，尤其是在气味方面，表现出明显的腊香味，而CK组的腊香味较淡，且有轻微的霉味，感官结果与挥发性风味成分结果基本一致，说明所添加的发酵剂能够改善腊肉的整体风味。

图5 不同处理组腊肉的感官雷达图Fig. 5 Sensory evaluation radar chart of naturally fermented and inoculated meat

3 结 论

本实验采用SPME-GC-MS技术，结合ROAV评价方法对不同二次接种时间发酵腊肉的挥发性风味化合物的差异进行检测分析，共检测出醛类、酯类、醇类、酸类、酮类、酚类、烯烃类等72 种挥发性化合物。其中，CK组腊肉共检出38 种，F-6组腊肉中检出51 种，F-10组腊肉中检出57 种，F-14组腊肉中检出43种，总量分别是6 031.07、6 556.89、6 528.27、6 053.56 μg/kg，添加复合发酵剂的腊肉的挥发性化合物在种类和含量上均高于CK组。综合PCA和热图分析结果，F-6组和F-10组腊肉的挥发性风味成分较相似，而F-10组腊肉的挥发性风味成分更丰富。ROAV结果分析显示，壬醛、苯甲醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、己酸乙酯、辛酸乙酯和1-辛烯-3-醇是复合发酵组的关键风味物质，且F-10组腊肉的关键性风味物质种类最多。感官结果显示，F-10组腊肉的腊香味更加明显，且感官评分最高。综合以上结论，接种复合发酵剂能显著增加腊肉挥发性风味物质的种类和含量，且在发酵中期（F-10）进行二次接种更有利于腊肉风味的形成，可为人工接种发酵腊肉提供理论依据。