柑橘精油成分分析及对灰葡萄孢菌的抑制作用

张金磊，陈兴煌

（福建农林大学食品科学学院，福建福州 350000）

草莓（Fragaria ananassaDuch.）果实柔软多汁，芳香馥郁，含有多种对人体有益的营养物质，素有“水果皇后”之称[1,2]。随着人们健康意识、经济水平的提高，对于草莓的需求逐年增加。而草莓果皮薄嫩，含水量高，极易受到病原菌侵染，引起腐烂。采后主要病害包括灰霉病、青霉病、软腐病和炭疽病，其中尤以灰霉病造成的损失最为严重[3]。

灰霉病是由病原真菌灰葡萄孢（Botrytis cinerea）侵染所致，属于低温高湿型病害，4 ℃以上灰葡萄孢即可萌发，7～20 ℃可产生大量孢子[4]。目前，对于果蔬灰霉病防治主要通过品种选育，田间管理，合理密植，适时采收，喷施化学药剂等措施降低果实带菌率和发病率，其中喷施农药是主要手段[5]。

但是，近年来由于对化学杀菌剂的使用不够科学合理，灰葡萄孢对嘧霉胺、嘧菌环胺、腐霉利、异菌脲等多种杀菌剂普遍产生抗性，世界范围内多有报道，新形态的灰葡萄孢菌不断被发现[6-8]。由于新产品迭代较慢，农产品残留剂量问题，以及人们食品安全意识的提高，环境保护的需要，化学杀菌剂的使用受到了严格限制。因此，全球趋势正在转向寻找更安全、更环保的替代方法来控制采后病害和腐烂[9]。

精油作为一类天然食品添加剂，广泛应用于医药、香精香料、调味品等诸多方面[10]；对真菌、细菌、病虫害等均具有抑杀作用，鉴于植物精油优良的抑菌抗氧化特性，有望取代或替代传统抑菌剂及杀菌剂[11]。柑橘精油被美国食品和药品管理局（FDA）认定为“一般认为安全（GRAS）的食品添加剂”[12]。关于其抑菌研究多有见报道[13,14]，如Tao等[15]的结果显示椪柑精油处理能够通过导致细胞质丢失和菌丝体变形来改变意大利青霉（Penicillium italicum）和指状青霉（Penicillium digitatum）菌丝结构；通过改变胞外电导率、细胞成分的释放以及总脂质含量对细胞产生毒性，导致菌体凋亡。Chutia等[16]研究了柑橘精油对5种植物病原真菌的影响，发现在2 mL/100 mL的精油中，尖芽孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和稻长蠕孢（Helminthosporium oryzae）孢子形成率仅为0.5%和0.25%，链格孢菌（Alternaria alternata）、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、新月弯孢霉（Curvularia lunata）的孢子的形成完全被抑制。

本研究以从福州地区分离的草莓灰霉病菌为研究对象，选用特早熟温州蜜橘橘皮精油对灰葡萄孢的抑制作用及抑菌机理进行探讨，以期为草莓灰霉病害的绿色防控提供一定的理论依据。

1 材料及方法

1.1 材料及试剂

材料：柑橘（特早熟温州蜜桔），9成熟，采自福建永安，当日（12 h内）运回，取皮，50 ℃干燥，粉碎，过40目筛，装袋于-20 ℃冰箱备用；草莓采自福州荆溪芳香草莓园，8～9成熟；本实验室分离、鉴定所得灰葡萄孢菌种。

试剂：马铃薯葡萄糖培养基（PDB）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），生化试剂，上海博微生物；活性白土，食品级，巩义龙腾水处理；其它常用化学试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器设备

ZHWY-2102C恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；DHP-9162恒温培养箱，太仓市科教器材厂；6890气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司；SpectraMax i3x多功能酶标仪，美国Molecular Devices。

1.3 试验方法

1.3.1 精油提取

1.3.1.1 水蒸气蒸馏

参照王会全等[17]的方法略有改动。取柑橘粉50 g于圆底烧瓶，加0.3% NaCl溶液，至料液比1:8，采用精油提取器加热蒸馏2 h，收集冷凝管油水混合物，加入经干燥的无水硫酸钠搅拌，静置，抽滤，将滤液存储于棕色瓶保存至-20 ℃冰箱待用。

1.3.1.2 有机试剂萃取

参照张钟等[18]的方法略有改动。称取柑橘粉50 g于三角烧瓶，加入正己烷，料液比1:6，超声波处理30 min，避光静置2 h，真空抽滤，将抽滤液转移至圆底烧瓶，用旋转蒸发仪于38 ℃旋蒸，回收有机试剂，待抽提液转变为油状物，体积不再减少，即为混有微量正己烷的精油混合物，经脱蜡，脱色[19]即得柑橘精油。

1.3.2 精油成分分析

色谱条件：色谱柱为Rtx-5 MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm），载气为高纯氦气（99.9%），流速为1 mL/min，分流比为40:1，进样口温度为220 ℃，柱温从50 ℃以3 ℃/min升温至220 ℃，然后保持2 min，进样量0.2 μL。

质谱条件：传输线温度220 ℃，EI电子源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，m/z扫描范围29～400。

1.3.3 精油对菌丝生长的抑制

参照马江锋等[20]方法略有改动。将10 mL不同浓度精油储备液分别加入到90 mL PDA培养基混匀，使终体积浓度分别为0.156%、0.312%、0.625%、1.25%、2.5%，以添加10 mL无菌水组为对照，倾注平板，冷却，接种9 mm菌柱于培养皿中央，置与25 ℃恒温培养，每日测量菌落直径，每个浓度平行处理3次。

1.3.4 精油对菌体生物量的影响

参照马江锋等[20]方法略有改动。90 mL PDB培养基中加入10 mL不同体积分数精油储备液，混匀，使精油终体积分数分别为 0.156%、0.312%、0.625%、1.25%、2.5%，以添加10 mL无菌水组为对照。每个处理接种1 mL孢子悬浮液（108cfu/mL）25 ℃震荡培养5 d，过滤收集菌丝，蒸馏水洗涤3次，于65 ℃烘干至恒重，每处理平行处理3次。

1.3.5 精油对菌体孢子萌发率的影响

参照马江锋等[20]方法略有改动。PDB培养基中加入不同浓度精油储备液，接种200 μL孢子悬浮液（107cfu/mL）混匀，使精油终体积分数分别为 0.156%、0.312%、0.625%、1.25%、2.5%，25 ℃震荡培养12 h，血球计数板镜检计数，以孢子出芽为依据。重复3次，取均值。

1.3.6 精油抑菌活性测定

采用 96孔版微量稀释法[21]测定柑橘精油对灰葡萄孢的最低抑菌体积浓度（MIVF）。具体方法：向第1孔加入100 μL 20%精油储备液，100 μL PDB培养基，进行二倍稀释使得第1～7孔精油浓度为10%～0.156%，第8孔加100 μL PDB作为生长对照，1～8孔接种100 μL浓度为106cfu/mL孢子悬浮液，终体积200 μL，混匀。第9孔加入200 μL PDB作为空白。25 ℃恒温培养，每24 h进行观察菌落生长状态，72 h肉眼观察无菌丝生长即为MIVF。

1.3.7 精油对细胞膜透性影响

参照马江锋等[20]方法略有改动。7 mL离心管加入3.6 mL无菌PBS，200 μL孢子悬浮液（107cfu/mL），200 μL精油储备液，使精油终体积分数分别为0.156%、0.312%、0.625%、1.25%、2.5%，对照添加200 μL 无菌水，25 ℃恒温震荡培养 24 h，10000 ×g，4 ℃离心30 min，酶标仪测定上清液260 nm波长处的吸光度值。

1.3.8 精油对草莓灰霉病发生的影响

参照Bi[22]选择红颜草莓为研究对象，75%乙醇浸泡1 min，捞出沥除多于液体于超净工作台自然晾干。将所有果实分为6组，每组20个果实，在超净工作台，每个草莓用打孔器打成直径3 mm、深5 mm的孔，接种15 μL菌液（孢子含量为6×105cfu/mL），室温定植12 h，5组分别添加15 μL体积分数分别为0.156%、0.312%、0.625%、1.25%、2.5%含有蒸馏油的精油储备液，以接种15 μL无菌水作为对照，置于无菌聚乙烯盒（5.6 L）。25 ℃培养10 d，以损伤接种处长出菌丝为标准，观察创口真菌生长状况。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 20.0对数据进行分析，应用一般线性模型单变量最小显著性差异法进行处理间差异分析，单因素方差分析进行个体差异分析，p＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 柑橘精油化学组分

由表1可知蒸馏油共鉴定出39种成分，醛类6种，烯萜类20种，醇类9种，酯类2种，酮类1种，有机酸1种，烯萜类占总量的98.15%。浸提油共鉴定出25种成分，烯萜类20种，醇类3种，烷烃类2种，未检测出醛类物质，其中烯萜类占总量的97.38%。两种精油主要成分均为柠檬烯、γ-松油烯，其中蒸馏油柠檬烯含量为82.37%，浸提油为85.25%，γ-松油烯在两者中的含量占比分别为7.78%和6.08%。这与陈潘等人[23]的研究结果柠檬烯（91.52%）、γ-松油烯（3.85%）等萜类化合物为柑橘皮精油的主要成分大体上相吻合，其次为β-月桂烯、α-蒎烯。其中柠檬烯含量最高，这与王会全等[17]的结果柠檬烯（84.22%）、萜品烯（6.55%)、β-月桂烯（1.67%）、α-蒎烯（1.13%）相吻合。两种方法所得精油成分组成存在的差异，可能是由于提取方法及纯化过程中的处理方式不同而造成。

表1 柑橘精油化学成分Table 1 Chemical constituents of citrus essential oils

续表1

2.2 精油对菌丝生长的抑制

由图2可知精油对菌丝生长有较好的抑制效果，蒸馏油与浸提油两种处理之间存在显著差异（p＜0.05），蒸馏油抑菌效果显著优于浸提油。浓度0.156%～0.625%不同处理相同浓度组间差异未达到显著水平（p＞0.05），即浓度低于 0.625%时两种精油对于菌丝的影响无差异。具体原因可能是固体培养环境下，精油与菌丝不能完全接触，灰葡萄孢菌丝为多核有隔菌丝，精油中对菌丝细胞壁起主要作用的是柠檬烯，细胞壁是柠檬烯的首要靶点，柠檬烯浓度未达一定限度，对细胞壁、细胞膜造成的破坏有限[24]，精油其它成分对于内容物不能达到相应效果所致。

2.3 精油对菌体生物量的影响

由图3可知精油对菌体生长量的抑制效果，随精油含量增加，抑制效果增强。浓度0.156%～0.625%时，两种处理同一浓度组间及同一处理不同浓度组间均存在显著差异（p＜0.05），浓度1.25%和2.5%时两种精油处理间及处理内不存在差异（p＞0.05），但经蒸馏油处理实验组的菌丝生长量低于浸提油处理实验组菌丝量。浓度 0.312%时蒸馏油对灰葡萄孢生长量的抑菌率已经达到了 90.71%，浸提油的抑制率仅为25.19%，浓度0.625%时，蒸馏油已经完全抑制，浸提油的抑制率为 80.74%。相较于固体环境对菌丝的影响，液体环境下精油对于菌丝生长的影响更为显著，可能是液体环境供氧量降低、精油能够与菌丝充分接触，柠檬烯迅速破坏细胞壁、细胞膜，其它多种抑菌成分进入胞内对菌体产生影响，而蒸馏油独有物质能够使细胞周期受阻、细胞核破碎，减缓灰葡萄孢的转录翻译速率，进而影响生长繁殖[25,26]，致蒸馏油更早达到完全抑制。

2.4 精油对菌体孢子萌发率的影响

由图4可知柑橘精油对灰葡萄孢孢子萌发率有一定的抑制作用，各处理组与对照的差异均达到显著水平（p＜0.05）。蒸馏油与浸提油处理浓度为 0.156%～0.625%时，同一浓度不同处理组间存在显著差异（p＜0.05），相较于对菌丝生长量的影响，相同浓度，对于孢子的抑制作用更弱，可能与孢子活性较低、抗逆境能力较强相关。蒸馏油的效果始终优于浸提油，可能与其含有更高含量对孢子产生影响的物质（如2-己烯醛、罗勒烯等）有关[27]。浓度为1.25%时，蒸馏油和浸提油萌发率分别为3.43%和4.04%，抑制率均达到了95%以上。由此说明，柑橘精油对灰葡萄孢菌的重要繁殖体有影响。

2.5 最小抑菌浓度测定

由表2可知72 h后蒸馏油浓度1.25%处理组有微量菌丝生长，浓度2.5%组未生长，MIVF为2.5%；浸提油浓度2.5%处理组有微量菌丝，5%处理组未生长，MIVF为5%。柠檬烯为柑橘精油主体物质，有研究表明 2 mg/mL柠檬烯处理灰葡萄孢即可达到完全抑制[28]，认为柠檬烯为精油主要抑菌物质，浸提油具有更高的柠檬烯含量，但其抑菌活性弱于蒸馏油，具体原因可能是蒸馏油成分的丰富性及其中含有多种与柠檬烯相当的抑菌物质及较高含量具有强效抑菌性能的含氧化合物（醇、醛）及各物质的协同增效作用相关[25,29]，如有研究表明芳樟醇、己烯醛等物质，其抑菌活性是柠檬烯的10～1000倍左右[30]。

表2 柑橘精油对灰葡萄孢的MIVFTable 2 MIVF of citrus essential oil against Botrytis cinerea

2.6 精油对细胞膜透性影响

浓度升高含量升高。蒸馏油浓度为1.25%、2.5%时260 nm波长处吸光值显著高于对照（p＜0.05），而0.156%、0.312%、0.625%实验组与对照的差异未达到显著水平（p＞0.05），表明浓度 0.625%以上会导致细胞透性明显增强，进而引起核酸外泄。浸提油各浓度处理实验组之间不存在显著差异（p＞0.05），但随精油处理浓度升高，核酸泄漏量整体呈上升趋势。对于细胞膜透性的影响，蒸馏油的效果整体优于浸提油，可能与蒸馏油含有较高含量的β-榄香烯及多种含氧化合物有关，如有研究表明β-榄香烯能促进细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻、细胞核破碎[25,31]。

2.7 精油对草莓灰霉病发生的影响

图6和图7反映了损伤接种实验各浓度处理组发病率和果实创口真菌生长情况。由图6可知精油处理组与对照的发病率均存在显著差异（p＜0.05），发病率介于80%～95%，浓度0.625%时发病率为仅为21.1%。由图7可观察到随蒸馏油浓度升高，创口处真菌菌丝生长受到的抑制作用增强，萼片处均有菌丝生长，且随处理浓度增高花萼处菌丝生长有减少趋势。浓度1.25%处理组几乎未发生真菌长出菌丝现象，浓度2.5%处理组损伤处菌丝完全未生长，达到完全抑制。具体原因可能与柑橘精油抑制菌体生长、某些物质能够促进草莓果实相关抗病基因的表达有关[32]。

由图7可以观察到浓度2.5%精油处理组草莓颜色较其余组明显偏淡，这种高浓度精油处理达到较好的抑菌效果，影响果实色度的现象与萨仁高娃[33]的结果相类似，究其原因可能是高浓度精油对细胞造成毒性，加剧了果实无氧呼吸，促进了果实软化腐烂所致。

3 结论

采用水蒸气蒸馏法所得精油共鉴定出39种成分，除烯萜类化合物外，含有醇、醛、酮、酸、酯在内的多种含氧化合物；有机试剂浸提法所得精油共鉴定出25种成分，主要为烯萜类、烃类、醇类化合物。共有主要成分为柠檬烯（limonene）、γ-松油烯（γ-Terpinene）、β-月桂烯（β-myrcene）、α-蒎烯（α-Pinene），总含量均达到精油组分的97%以上。其中，柠檬烯为最主要成分，蒸馏油柠檬烯含量为82.37%，浸提油为85.25%。抑菌实验结果表明两种精油对灰葡萄孢均具有较好的抑制效果，其中蒸馏油MIVF为2.5%，浸提法精油MIVF为5%。体外抑菌实验表明，精油能够通过对灰葡萄孢的菌丝、生长量、孢子萌发率、细胞透过性产生影响，诱导细胞凋亡，且蒸馏油的效果优于浸提法精油。草莓抑菌实验表明柑橘精油能够有效抑制灰葡萄孢在草莓果实上的生长，但过高浓度精油处理会对草莓品质产生负面影响。