白灵菇液体发酵菌种培养终点初探

刘海娟 刘利娟 郭纹余 常晓宁 郑素月 郭金英

（河北工程大学，河北邯郸 056001）

白灵菇Pleurotus tuoliensis又名阿魏侧耳、阿魏蘑菇、阿魏蘑、阿魏菇等，是一种食、药用性都很高的珍稀食用菌。美味可口、营养丰富[1]的白灵菇不仅食用价值较高，还具有一定的药用价值，如具有降血压[2]、降血脂[3-4]、抗氧化、抗疲劳[5-6]、抗肿瘤、抗辐射及提高免疫力[7-8]等功效，所以常被称为白灵芝。

液体发酵终点传统的判断方法主要以发酵瓶质量变化[9-10]为依据，此方法在液体发酵培养终点的报道中相对较多，但是用于食用菌方面的较少。虽然以发酵瓶质量变化为参数，结合生长曲线判断液体发酵的培养终点方法简便，但无法确定菌丝活力。因此，结合漆酶[11]、羧甲基纤维素酶、半纤维素酶等酶活测定判断液体发酵培养终点能判定出菌丝的老化程度，找出菌丝质量较好的发酵时间点，从而更好地应用于生产。余昌霞等[12]用传统方法配合酶（漆酶、羧甲基纤维素、半纤维素酶）活性测定判断草菇液体菌种的培养终点应在84～96 h。许修宏等[13]从不同添加物的角度进行木耳液体菌种老化的研究，通过测定氧化还原物质及氧化还原酶酶活性得出菌丝抗氧化能力是随着发酵时间而变化。抗氧化能力强的菌丝质量较好[14]，并且用于生产后可提高菌丝对栽培基质中营养的利用率。

笔者通过对白灵菇液体发酵菌种定性、定量分析及栽培试验，找出菌丝质量较好的发酵培养终点，以缩短白灵菇生产周期，提高生物转化率。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌株为“白杂65”，由河北工程大学食用菌实验室杂交选育而成。

1.2 供试培养基

固体培养基：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖25 g，酵母膏7 g，MgSO40.5 g，KH2PO42 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH自然。

液体培养基：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖25 g，酵 母 膏7 g，MgSO40.5 g，KH2PO42 g，蒸 馏 水1000 mL，pH自然。

栽培料培养基：棉籽壳78%，麸皮20%，石灰1%，石膏1%，含水量约60%。

1.3 液体发酵培养方法

液体发酵培养方法参考文献[15]。

1.4 液体菌种定性分析

1.4.1 菌球感官观察

300 mL 三角瓶液体培养基装液量为100 mL，接种10 mL 液体菌种，在恒温摇床中25 ℃、转速170 r/min进行培养。试验设三次重复，共9瓶。从第0 天开始记录发酵液气味、颜色，菌球密度、颜色、外观等。

1.4.2 显微镜检检测锁状联合数量变化

用镊子将菌球置于干净的载玻片上，在酒精灯上将菌丝烤干，滴入1 滴结晶紫染色1～2 min，水洗，烤干，每天观察记录菌丝锁状联合数量，并绘制出白灵菇液体发酵菌种在发酵过程中菌丝锁状联合数量变化的曲线图。

1.4.3 回接平板试验

在超净工作台中，用镊子将菌球置于PDA 平板培养基中心，在温度为25 ℃的恒温培养箱中培养，每12 h观察一次菌球萌发状态。

1.5 液体菌种定量分析鉴定

1.5.1 发酵液pH测定

在超净工作台中取液体发酵培养时间为第0天、第1 天、第3 天、第5 天、第7 天、第9 天的10 mL发酵液于玻璃烧杯中，用pH计测发酵液pH并记录。每组3次重复。

1.5.2 可溶性蛋白含量测定

移取2 mL 发酵液至离心管中，8000 r/min 离心10 min，取上清液即为可溶性蛋白质待测液。每隔24 h 提取一次，每个重复提取3 个待测液。蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法[16]。

1.5.3 还原糖含量测定

从发酵培养第2 天开始，每隔24 h 移取2 mL 发酵液于离心管中，4 ℃8000 r 离心10 min 取上清液即为还原糖待测液，每组3 个重复。还原糖含量测定采用DNS法[16]。

1.5.4 ABTS法测定漆酶酶活性

移取1 mL 发酵液转移至离心管中，以12000 g离心10 min，取上清液即为漆酶粗酶液。漆酶活性测定及计算公式参考文献[16]。

1.6 栽培方法

按照配方制备栽培料，含水量为60%。将栽培料装入17 cm×38 cm×0.0045 cm 的高压聚丙烯塑料袋，并在料袋中心插入锥形棒，高温高压灭菌锅灭菌90 min。灭菌料袋冷却后同时接入液体和固体菌种，接液体菌种10～20 mL（发酵培养第5 天）；固体菌种接种时，将每个固体（平板）培养基平均切4块，每个栽培料袋接种2 块。设3 次重复，每个重复3袋，置于培养室25 ℃避光培养发菌。菌丝长满袋之日起进入后熟期，将后熟期结束后的菌袋置于夜晚10 ℃以下，白天15 ℃，通风良好，空气相对湿度为85% 处，避光培养，并适时疏蕾，保证每个菌袋有1～2 个健壮的菇蕾。当菇蕾形成后将菇房温度调整为15 ℃，空气相对湿度为90%～95%，通风良好，自然昼夜光照。当白灵菇子实体菌盖完全展开，菌盖边缘内卷、孢子尚未弹射时采收。

记录菌丝满袋时间、出菇日期，统计子实体鲜重，测定子实体菌盖纵径、横径、菌盖厚度、菌柄长度，计算生物转化率。

2 结果与分析

2.1 液体菌种定性分析

2.1.1 菌球感官变化

液体发酵培养过程中，发酵液颜色、气味与菌球密度、颜色、外观等都随发酵时间的变化而变化。由表1可知，随发酵时间延长，发酵液颜色由深棕黄色变为浅棕黄色，酵母膏气味由浓变淡逐渐消失，且发酵后期出现酒精气味；菌球密度由稀疏到稠密再到黏稠，菌球颜色由浅棕黄色到洁白最后呈现出中心发黄的现象，壁挂白灵菇菌丝（以下称菌丝）由深棕黄色线条至洁白浓密。

表1 发酵液及菌球感官变化

2.1.2 显微镜检测菌丝锁状联合数

由图1 可见，菌丝锁状联合数量随着发酵培养时间的延长呈现先升高后下降的趋势。当液体菌种培养至第5 天时，菌丝锁状联合数最多，为24 个。液体发酵后期，菌丝空泡现象比较严重，发酵前期形成的锁状联合会随着菌丝空泡加剧呈现出菌丝锁状联合空心的现象，即可推测菌丝已经严重老化，活力降低（图2a）。当空泡严重程度更加恶化时，菌丝开始断裂出现自溶现象（图2b）。

图1 发酵培养过程菌丝锁状联合个数

图2 发酵培养第8天的菌丝锁状联合形态（箭头所指）

2.1.3 回接平板试验分析

由图3可知，随着发酵时间延长，菌球回接平板萌发时间呈先降低再升高的趋势。发酵第2天、第3天时，菌球回接平板萌发时间较长。当发酵培养至第5 天、第6 天时，回接平板的菌丝萌发时间最短，为16 h，此时菌丝活力较高，生长速度快。当液体发酵培养至后期时，菌球回接平板萌发时间较长，表明菌球活力下降。

图3 液体菌种菌球回接平板萌发时间

2.2 液体菌种定量分析

2.2.1 发酵液pH变化

由图4可知，随着发酵时间延长，发酵液中pH变化趋势为先上升后下降再上升。发酵后期，发酵液pH升高，推测可能由于菌丝老化严重，自溶或死亡，菌丝体内代谢物溶解到发酵液中导致发酵液pH升高。

图4 发酵液pH变化

2.2.2 发酵液中还原糖质量浓度变化

由图5可知，随着发酵时间延长，发酵液中还原糖质量浓度总体呈下降趋势。发酵第2 天、第3 天时，菌丝生长缓慢还原糖消耗较少；发酵第4天、第5天时，菌丝生长较快，活力较强还原糖消耗较快，推测此时菌丝可能处于对数生长期；发酵第6天开始，还原糖消耗量减少并趋于平稳。

图5 发酵液中还原糖质量浓度变化

2.2.3 发酵液中可溶性蛋白质量浓度变化

由图6可知，发酵第2天、第3天时，发酵液中可溶性蛋白质量浓度趋于平稳。发酵第4 天、第5 天时，发酵液中可溶性蛋白质量浓度上升，表明此时菌丝生长迅速，由菌丝体溶解到发酵液中，致使可溶性蛋白质量浓度上升。发酵第7 天、第8 天时，发酵液中可溶性蛋白质量浓度再上升，此时期菌丝因空泡导致断裂或自溶，可能导致菌丝体内可溶性蛋白大量流失到发酵液中，从而使发酵液中可溶性蛋白质量浓度上升。

图6 发酵液中可溶性蛋白质量浓度变化

2.2.4 漆酶酶活性变化

由图7可知，发酵培养过程中，漆酶酶活性呈现先升高后降低的特点。发酵第2 天、第3 天时，菌丝生长速度较慢，漆酶酶活性较低；发酵培养至第4天、第5 天时，漆酶活性迅速上升，促进菌丝对营养成分的吸收，从而使菌丝生长迅速。发酵后期菌丝逐渐老化，漆酶活性也相对降低。发酵第8天时，菌丝老化严重甚至死亡，漆酶活性急剧下降，此时的菌丝生长较慢，甚至部分菌丝不再生长。

图7 漆酶活性随培养时间的变化

2.3 栽培试验结果

2.3.1 袋料菌丝生长情况

液体菌种接种的栽培袋内菌丝生长速度明显比固体菌种快。液体菌种菌丝满袋时间、采收时间比固体菌种提前15 d，即栽培周期缩短15 d（表2、图8）。

表2 菌丝满袋时间及采收时间

图8 培养第31天时栽培袋发菌对比

2.3.2 白灵菇子实体经济性状分析

由表3 可知，液体菌种栽培的子实体鲜重平均为500 g，生物转化率为100%。固体菌种的鲜重平均为280 g，生物转化率为56%。子实体菌盖纵径、横径，液体菌种比固体菌种好，具有显著差异，而菌盖厚、菌柄长度无差异。

表3 白灵菇子实体经济性状

3 小结

从液体发酵感官观察得出发酵第5 天左右，菌丝生长最好。显微镜镜检锁状联合、回接平板萌发试验及漆酶酶活性测定结果表明，液体发酵第5 天时菌种活力最强。

液体发酵工艺有分批发酵[17]、连续发酵[18]和补料分批发酵[19]三种发酵方式。分批发酵中微生物生长的四个时期比较明显、操作简单，应用较广泛。随发酵时间的延长，结合发酵液中漆酶、还原糖、可溶性蛋白的含量及发酵液中pH 的变化曲线图可推测出，白灵菇液体菌种在发酵过程中存在微生物生长的四个时期。发酵第4 天、第5 天时，菌丝处于对数生长期，此时期菌丝生物量增长较快，表明此时期菌丝活力达最强。将此时期的液体菌种接于栽培料中，菌丝满袋时间及生物转化率均高于常规固体菌种。因此，综合结果表明，白灵菇液体发酵菌种培养最适时间为5 d左右。