盐酸小檗碱纳米乳口服给药系统的制备及体外评价

戴玮莉，金 婴，王 婷，唐晓萌，顾 清（.上海市静安区闸北中心医院药剂科,上海 00070；.山东中医药大学药学院,山东 济南 5055；.海军军医大学第一附属医院药剂科,上海 004）

小檗碱是从毛茛科植物根茎中提取的一种季胺类异喹啉类生物碱，又称黄连素，为中药黄连的主要成分，临床多用其盐酸盐。盐酸小檗碱（BBR）的药理作用主要为清热解毒，属于传统的消化系统用药，临床上常用作抗菌剂，用于治疗细菌性痢疾、肠胃炎等肠道感染[1-2]。盐酸小檗碱溶解度低，渗透性差，在口服给药时，还存在药物释放快、半衰期短、生物利用度低等缺陷。对于需要达到一定血药浓度为疗效前提的疾病来说，盐酸小檗碱的传统剂型还无法达到理想的治疗效果[3]。

纳米乳（NE）是由油相、水相、表面活性剂、助表面活性剂组成的脂质纳米给药载体。粒径范围为1～100 nm，液滴呈大小均匀的球形，外观呈透明或半透明。纳米乳是一种热力学稳定的胶体分散体系，制备工艺简单，所需能量低甚至能够自发形成。纳米乳处方中油相和表面活性剂、助表面活性剂等组成成分的增溶效果，可以显著提升难溶性药物的溶解度。纳米乳小且均匀的粒径，可透过胃肠道的水化层，改善胃肠上皮细胞对药物的吸收。纳米给药体系具有较低的表面张力，可提高膜的通透性，促进药物吸收，提高其生物利用度[4]。纳米乳自身的独特优势，使其具有广泛的临床应用范围，可通过口服、透皮、注射等多种途径给药[5-6]。

本研究结合纳米乳剂型的优势，制备了盐酸小檗碱口服纳米乳(BBR-NE)，采用伪三元相图法和星点设计-效应面法优化了制备工艺，并对其体外特性进行表征，从而解决盐酸小檗碱口服给药剂型溶解度差、生物利用度低等问题，提高药物的疗效，为小檗碱的临床应用提供新的给药剂型[4]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

101A-2 型干燥箱（上海实验仪器总厂）；AG285 十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；SB100D 超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Agilent 1 100 高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；EPPENDORF 5804R 高速冷冻离心机（德国Eppendorf 有限公司）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）；Zetasizer Nano ZS90 测定仪（英国马尔文公司）。

1.2 试药

盐酸小檗碱原料药（批号XC20170113，西安小草植物科技有限公司）；盐酸小檗碱对照品（批号110713-201212，纯度>86.7 %，中国食品药品检定研究院）；1,2-丙二醇（批号20181008，上海凌峰化学试剂有限公司）；吐温-80（批号2015021，上海凌峰化学试剂有限公司）；甘油（批号20191110，上海源叶生物科技有限公司）；聚乙二醇400（PEG400，批号970248，上海浦东高南化工厂）；聚氧乙烯氢化蓖麻油（RH-40，批号19523275L0，德国 BASF 公司）；烷基糖苷0810（APG，平均聚合度1.2～1.8，批号170502，上海发凯化工有限公司）；丙二醇单辛酸酯（Capryol 90，批号170857，上海嘉法狮贸易有限公司）；肉豆蔻酸异丙酯（IPM，批号F20160731，国药集团化学试剂有限公司）；橄榄油（批号F20180725，中国医药集团上海化学试剂公司）；中链脂肪酸（MCT，批号193717，嘉法狮（上海）贸易有限公司）；大豆油（批号20190801，江西金海棠药用油有限公司）；蓖麻油（批号20180815，上海凌峰化学试剂有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国TEDIA 有限公司）；羟丙甲基纤维素（HPMC，批号H08827，阿拉丁生化科技股份有限公司）；水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 盐酸小檗碱HPLC 含量测定方法的建立[7-8]

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil BDS C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：乙腈-0.05 mol/L 与磷酸二氢钾（0.5 %三乙胺，磷酸调至pH=3）等度洗脱，比例：30∶70，流速1.0 ml/min，紫外检测波长345 nm，柱温25 ℃，进样量20 μl。

2.1.2 方法学考察

精密称取盐酸小檗碱对照品1.0 mg，用甲醇稀释定容于10 ml 量瓶中作为储备液，用甲醇逐级稀释成系列对照品溶液，按上述色谱条件进样测定。称取适量盐酸小檗碱纳米乳于10 ml 量瓶中，加入甲醇超声破乳30 min，10 000 r/min 离心5 min，取1 ml上清液于10 ml 量瓶中，加甲醇定容后过0.45 μm微孔滤膜即得供试品溶液。方法学考察表明，盐酸小檗碱在1.00～100.00 μg/ml 浓度范围内呈良好的线性关系，回归方程为：Y=37.059X+16.952（r=0.999 9）。低、中、高浓度的盐酸小檗碱对照品溶液的日内精密度分别为0.68 %、1.64 %、0.80 %，日间精密度分别为0.95 %、0.23 %、013 %，加样回收率RSD 分别为1.42 %、0.70 %、1.57 %，表明该方法可用于纳米乳中盐酸小檗碱的含量测定。

2.2 盐酸小檗碱纳米乳的制备[4]

2.2.1 油相、表面活性剂和助表面活性剂的筛选

采用水滴加法制备盐酸小檗碱纳米乳。根据各类溶剂口服的安全性，筛选出以下各相备选溶剂，以BBR 的溶解度为指标，确定各相最佳选择。

油相：Capryol 90、蓖麻油、橄榄油、大豆油、IPM、MCT；表面活性剂：吐温-80、APG、RH-40；助表面活性剂：1,2-丙二醇、PEG400、甘油。在具塞玻璃离心管中加入5 ml 上述各溶剂与过量盐酸小檗碱，置于恒温（25 ℃）振荡器振摇（100 r/min）72 h，得到以上各溶剂的饱和盐酸小檗碱溶液。取该饱和溶液于5 000 r/min 条件下离心10 min，吸取1 ml上清液置于5 ml 量瓶中，加甲醇稀释定容之后过0.45 μm 微孔滤膜，按“2.1.1”项下色谱条件进样检测。

结果如图1 所示：油相中盐酸小檗碱的溶解度从大到小依次为：Capryol 90>MCT>蓖麻油>大豆油>橄榄油>IPM；表面活性剂的顺序为：吐温-80>APG>RH-40；助表面活性剂的顺序为：1,2-丙二醇>甘油>PEG400。即盐酸小檗碱在Capryol 90、吐温-80、1,2-丙二醇中溶解度最大，故选择Capryol 90 为油相，吐温-80 为表面活性剂，1,2-丙二醇为助表面活性剂。

图1 盐酸小檗碱在各相溶剂中的溶解度

2.2.2 表面活性剂与助表面活性剂质量比（Km）的筛选

按照上述筛选的结果，将表面活性剂和助表面活性剂按照Km分别为1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1 的比例混合，再取油相与此混合表面活性剂按照1∶9、2∶8；3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1 的质量比配制成混合溶液，在磁力搅拌下滴加蒸馏水。观察溶液的颜色、乳光和澄明度，判断临界点，记录体系由浑浊变澄清时的加水量，计算临界点时各组分的比例。用Origin 10.0 软件绘制伪三元相图，图中各临界点连线下方的区域即为纳米乳区，比较该区域面积大小，确定表面活性剂与助表面活性剂的质量比[9-11]。结果见图2。图中阴影部分即为成乳区，且当Km为2∶1 时达到最大，故将Km定为2∶1。然而在实际制备纳米乳过程中，处方中各组分的不同比例会产生交互影响作用，因此，需要进一步采用星点设计-效应面法优化盐酸小檗碱纳米乳的制备工艺。

图2 不同Km 值BBR 纳米乳的伪三元相图

2.2.3 星点设计-效应面法优化盐酸小檗碱纳米乳处方[4]

选择对纳米乳影响较大的表面活性剂与助表面活性剂质量比Km（X1）和油相质量百分数（X2）作为考察因素，以多分散系数（PDI，Y1）和载药量（Y2）为考察指标。实验过程中发现当Km≥4 时，大部分处方难以成乳；当Km≤1:2 时，平均粒径>100 nm，故将Km范围定在1∶1 至3∶1。当含油量增至0.5 g（50 %）时，平均粒径已接近100 nm，而当含油量范围在0.2～0.5 g（20 %～50 %）时，可将粒径控制在100 nm 之内。根据单因素试验结果确定了Km的取值范围和油相质量百分数，并将两个评价指标进行归一化，将每个指标换算成0～1 之间的“归一值（OD）”,并求算几何平均数，得总评“归一值”。计算公式如下:OD=(d1d2d3…...dk)1/k（k 为指标数）。对取值越小越好的因素（PDI）和取值越大越好的因素（载药量）采用Hassan 法[9]分别进行数学转换，求归一值dmin和dmax，公式如下：dmin=(Ymax−Yi)/(Ymax−Ymin)；dmax=(Yi−Ymin)/(Ymax−Ymin)。采用2 因素5 水平星点设计优化处方，因素水平见表1，星点设计各组实验结果见表2。

表1 星点设计因素水平表

表2 星点设计各组实验结果

对X1进行二次式回归，得到方程R1=0.23+0.06A+3.22×10−3B−2.75×10−3AB+0.03A2+0.03B2，（r=0.970 8），P<0.001；对X2进行二项式回归，得到方程R2=0.81−0.04A+0.06B+1.37×10−3AB−0.01A2+0.01B2，（r=0.913 5），P<0.05；对总归一值（OD）进行二项式回归，方程为OD=0.87−0.28A+0.03B−0.01AB−0.03A2−0.34B2，（r=0.910 2），P<0.05。以OD 作为指标时，为使方程有效，对其进行方差分析，结果见表3。由表3 可知，模型的P<0.05，说明OD 与X1、X2回归方程的非线性关系显著。回归方程的相关系数r=0.910 2，表明模型能说明91.02 %响应值的变化，拟合情况良好，回归方程具有较好的代表性，能准确预测实际情况[12]。

表3 星点设计-效应面法优化纳米乳处方方差分析表

由拟合曲线可绘制X1、X2和OD 值的关系，所绘制的三维效应面和二维等高线如图3 所示。利用Design Expert 8.0 软件的预测分析功能，根据拟合回归方程、三维效应面图和二维等高线图综合分析，得到最佳处方为X1=0，X2=0.53，预测值OD 为0.621 4。故优化后的盐酸小檗碱纳米乳处方为：油相Capryol 90 占体系的32.84 %，表面活性剂吐温-80 占体系的33.90 %，助表面活性剂1,2-丙二醇占体系16.95 %，水相占体系15.25 %[4]。

图3 因变量Y 随自变量X 变化的三维效应面和二维等高线图（a）X1，X2，Y1；（b）X1，X2，Y2；（c）X1，X2，OD。

2.2.4 最优处方的验证

对最优处方进行处方验证，结果如表4 所示，预测值OD 为0.621 4，实际OD 值为0.651 0，偏差为4.76 %。表明预测值与实测值之间偏差较小，表明星点设计-效应面法（CCD-RSM）可用于筛选盐酸小檗碱纳米乳，筛选的处方预测良好、可靠。

表4 最优处方验证结果

2.3 盐酸小檗碱纳米乳的体外表征[4]

2.3.1 BBR-NE 载药量的测定

取适量BBR-NE 于10 ml 量瓶中，加甲醇超声破乳30 min，加甲醇稀释定容。4 ℃离心（10 000 r/min，5 min），吸取1 ml 上清液置于10 ml 容量瓶中，加甲醇稀释定容后即得样品溶液。按“2.1.1”项下色谱条件进样检测，计算纳米乳的载药量。测定结果如表5。

表5 盐酸小檗碱纳米乳的载药量测定结果(±s，n=3)

表5 盐酸小檗碱纳米乳的载药量测定结果(±s，n=3)

2.3.2 BBR-NE 粒径大小与分布的测定

按照最优处方制备BBR-NE，稀释到适宜浓度，均匀分散后，采用马尔文激光粒度分析仪测定纳米乳的粒径大小。粒径结果如图4 和图5 所示。所制备的BBR-NE 粒径分布范围窄且呈正态分布，平均粒径为（68.85±8）nm，PDI 为(0.245±0.03)，表明该制剂粒径分布及均匀性均符合纳米乳制剂要求。

图4 最优处方（201119）纳米乳粒径分布图

图5 最优处方（201119）纳米乳电位分布图

2.3.3 BBR-NE 的形态学考察

采用透射电镜（TEM）观察所制备的BBRNE 的形态。取适量BBR-NE 滴于铜网上，自然干燥后滴加2 %磷钨酸（pH=7.4）溶液于铜网上负染3 min，晾干后置于透射电镜下观察其外观形貌。最优处方制备的纳米乳的透射电镜如图6 所示。结果表明，BBR-NE 呈均一圆整的球形，具明显层状结构，粒径大小约为68 nm。

图6 最优处方（201119）纳米乳的透射电镜图

2.3.4 BBR-NE 体外释放度的测定[4]

取制备好的盐酸小檗碱纳米乳2 ml，置于透析袋（分子截留值为7 000）中。于pH 1.2 的人工胃液中释放2 h，再于pH 6.8 的人工小肠液中释放22 h，溶出介质体积满足漏槽条件。将透析袋置于离心管中（含30 ml 透析液），在恒温振荡器（37 ℃，100 r/min）中释放24 h，分别于0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、16、20、24 h 定时取样1 ml，随后立即补加等温等体积释放介质。收集的样品过0.45 μm 滤膜后，按照“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算累积释放度。释放曲线如图7 所示，拟合方程如表6 所示。

表6 盐酸小檗碱纳米乳释药曲线的拟合方程

图7 盐酸小檗碱纳米乳的体外释放曲线 (±s，n=6)

由释放曲线可以看出，BBR-NE 在人工胃液中（0～2 h）累积释放度很低（<20%），进入人工小肠液后（2～24 h）释放度逐渐上升，累积释放度达到80 %以上，表明该制剂具有一定缓释效果，其释药行为符合一级动力学方程。

3 讨论

纳米乳的处方筛选过程中，目前常采用绘制伪三元相图、正交试验设计法、星点设计-效应面法等方法。其中，伪三元相图法的精度不高，常用于初筛[13-14]；正交试验设计法在因素水平较少时试验次数虽不多，但由于采用线性模型拟合，预测性较差[15]；而星点设计-效应面法各因素对效应的影响拟合结果多数是非线性，可从效应面上选择最佳效应区域，适合于多因素、多水平的处方优化。

在应用伪三元相图筛选Km时，随着表面活性剂和助表面活性剂质量比的增加，形成纳米乳区域的面积逐渐增加，当Km为2∶1 时最大，而后稍有减小。这是由于加入吐温-80 的比例增加，纳米乳的乳化作用增强。因此需要综合考虑选择最佳的Km值。

本研究在单因素筛选的基础上，利用星点设计-效应面法，以载药量及外观形态为考察指标，优化并确定了盐酸小檗碱纳米乳的最优处方：油相Capryol 90 占体系32.84 %，表面活性剂吐温−80 占体系33.90 %，助表面活性剂1,2-丙二醇占体系16.95 %，水相占体系15.25 %，载药量为0.829 mg/g。外观形态分析，表明所制备的BBR-NE 呈圆整均一的球体且具有明显的层状结构，平均粒径为 (68.85±8) nm，呈正态分布，多分散系数为(0.245±0.03)，说明该制剂粒径大小符合纳米乳粒径要求且均匀性好[4]。由验证试验结果可知，该制备工艺稳定可行，有望为盐酸小檗碱临床应用提供一种新的给药剂型。