二陈汤对肥胖型多囊卵巢综合征和肥胖型不孕的“异病同治”研究

蔡孟成，金永生，俞超芹，程 雯，俞 瑾，周 玲（海军军医大学：.基础医学院,.药学系,.中医系,上海 200433）

“异病同治”是指不同的疾病，病机相同，采用相同的方法进行治疗。中医学认为肥胖型多囊卵巢综合征（obese polycystic ovary syndrome，OPCOS）与肥胖型不孕（obese infertility，OI）是两种不同的疾病，但病因病机却相同，都是“恣于酒食”，致使“躯脂满溢，湿痰闭塞子宫”，辨证都可以辨为“痰湿阻滞证”。燥湿化痰是治疗痰湿证的重要法则。因此，利用燥湿化痰的方法治疗这两种疾病符合“异病同治”理论。二陈汤出自《太平惠民和剂局方》，由半夏、陈皮、茯苓、甘草四味中药构成，具有燥湿化痰，理气和中的功效，是治疗痰湿证的基础方。近年来，随着网络药理学研究的深入，“异病同治”成为了中药现代化研究的重要方向：项昌培[1]等研究了三七对糖尿病肾病、糖尿病脑病和糖尿病心肌病的“异病同治”；沈浮[2]等研究了追风透骨胶囊对类风湿关节炎和骨关节炎“异病同治”；丁珊珊[3]等进行了二陈汤治疗“慢性阻塞性肺病”、“多囊卵巢综合征”与“非酒精性脂肪肝”的“异病同治”研究。本文旨在利用网络药理学的方法探讨二陈汤“异病同治”肥胖型PCOS 与肥胖型不孕的物质基础与作用机制，以期探讨二陈汤治疗肥胖型PCOS 与肥胖型不孕的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 中药活性成分及靶点获取

利 用 TCMSP 数据库（https://tcmspw.com/tcmsp.php）以半夏、陈皮、茯苓、甘草为关键词进行检索，获取各药成分。再利用口服生物利用度（OB）≥30%以及类药性（DL）≥0.18 进一步筛选，获取各药中的潜在活性成分。根据得到的潜在活性成分，通过TCMSP 数据库收集其靶点[4]。

1.2 疾病靶点获取

利用GeneCard（https://www.genecards.org/）与OMIM 数据库（https://omim.org/）以obesity、polycystic ovary syndrome、infertility 等为关键词进行检索，获得相应疾病靶点。将肥胖与不孕的靶点交集获得肥胖型不孕靶点（#1），将肥胖与PCOS 靶点交集获得肥胖型PCOS 的靶点（#2）[5]。

1.3 化合物-靶点网络构建

将“1.1”项下二陈汤的靶点与“1.2”项下肥胖型不孕的靶点进行交集，得到#3；二陈汤与肥胖型PCOS 的靶点进行交集，得到#4。#3 与#4 交集得到#5，#5 即为肥胖型不孕与肥胖型PCOS 的公共靶点；#6=#3−#5 即为肥胖型不孕的独有靶点；#7=#4−#5 即为肥胖型PCOS 的独有靶点。利用Cytoscape3.7.1软件构建活性成分-靶点网络。

1.4 蛋白互作网络构建

利用STRING（https://www.string-db.org/）构建蛋白互作网络，物种选择人类，相关度设置为>0.900，其余保持默认设置，得到蛋白互作网络图，图中节点代表蛋白，连线代表蛋白与蛋白间的相互作用关系，度值越高，说明蛋白越关键。最后下载蛋白互作关系文件（tsv 格式），并粘贴KEGG 分析出的通路名称、基因比、P值以及基因数目至Excel 表格。

1.5 GO 及KEGG 富集分析

利用CytoScape 3.7.1 软件中的ClueGo 功能对公共靶点进行GO 生物过程富集分析，P值设定为<0.05，生物过程中至少包含15 个基因，合并类似生物过程，保存结果，将结果可视化。将“1.4”项下KEGG 的结果导入线上作图软件，选取与肥胖型不孕和肥胖型PCOS 相关的通路绘制KEGG 富集分析图，并根据KEGG 富集分析结果从KEGG 网站（https://www.kegg.jp/）上下载通路图，将二陈汤能够干预的靶点标记为红色。

1.6 分子对接

利用Pubchem 数据库获取“1.3”项下得到度值较高活性成分的三维结构，保存为SDF 格式，进一步利用openbabel 转化为PDBQT 格式。利用PDB数据库获取“1.4”项下得到的度值最高的蛋白的结构（PDB 格式），利用Pymol 对该蛋白进行去配体操作，再利用Autodock 软件进行去水、加氢、加电荷操作，保存为PDBQT 格式。根据PDB 数据库中配体的活性位点设置本次对接的活性位点，运行Autogrid与Autodock 进行配体与蛋白的对接，并获得相应的结合能，最后利用Pymol 将分子对接结果可视化。

2 结果

2.1 中药活性成分及靶点获取

从TCMSP 数据库中，检索到半夏成分116 个，陈皮成分63 个，茯苓成分34 个，甘草成分280 个。根据OB、DL 进行筛选，获取到半夏潜在活性成分13 个，陈皮潜在活性成分5 个，茯苓潜在活性成分15 个，甘草潜在活性成分92 个。共对应靶点2 031 个，去除重复靶点后，获得靶点218 个。

2.2 疾病靶点获取

利用GeneCard 与OMIM 数据库获得肥胖相关靶点9 513 个，PCOS 靶点4 797 个，不孕症靶点4 171 个。肥胖与不孕症的交集靶点为2 783 个，肥胖与PCOS 交集靶点2 962 个，见图1。

图1 中药靶点与疾病靶点维恩图

2.3 活性成分靶点网络构建

肥胖与不孕的交集靶点为肥胖型不孕靶点（#1），肥胖与PCOS 的交集靶点为肥胖型PCOS 靶点（#2），二陈汤与肥胖型不孕的交集靶点为136 个（#3），二陈汤与肥胖型PCOS 的交集靶点为149 个（#4），#3 和#4 的交集靶点（#5）为117 个，二陈汤治疗肥胖型不孕的独有靶点为19 个（#6），二陈汤治疗肥胖型PCOS 的独有靶点为32 个（#7），见图1。节点代表成分或靶点，边代表成分与靶点之间的相互作用关系，某一个节点散发的边越多，说明其度值越高，在网络中占据重要地位。其中红色菱形代表二陈汤潜在活性成分，绿色圆形代表肥胖型不孕与肥胖型PCOS 的公共靶点，蓝色圆形代表肥胖型不孕的独有靶点，紫色圆形代表肥胖型PCOS 的独有靶点，见图2。根据度值的大小由高到低进行排序，度值排名前5 名的药物为槲皮素、山奈酚、柚皮素、黄芩苷和刺芒柄花素，其度值分别为116、41、25、24、23，度值排名前5 的靶点包括前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、雌激素受体1（ESR1）、雄激素受体（AR）、过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）和一氧化氮合酶2（NOS2），其度值分别为116、91、78、69、66。

图2 活性成分-靶点网络图

2.4 蛋白质相互作用网络

将二陈汤治疗肥胖型不孕的117 个靶点与二陈汤治疗肥胖型PCOS 的149 个靶点分别导入STRING 软件，得到蛋白互作网络图。经过相关度>0.9 筛选后得到二陈汤干预肥胖型不孕的节点数为123 个，边有1 022 条，平均节点度值为8.31；二陈汤干预肥胖型PCOS 的节点数为133 个，边有1 086 条，平均节点度值为8.17。将STRING 软件导出的二陈汤治疗肥胖型不孕和二陈汤治疗肥胖型PCOS tsv 格式文件导入Cytoscape 3.7.1 软件进行网络拓扑参数分析，选取度值大于20 的节点作为关键节点进行可视化。其中圆圈半径越大、颜色越深表示该节点处于重要地位，连线越粗颜色越深代表两个节点的相关性越强。筛选得到二陈汤治疗肥胖型不孕的关键靶点包括STAT3、JUN、AKT1、MAPK3、MAPK1、RELA、IL-6、MAPK14 和FOS，见图3A 和图3B；二陈汤治疗肥胖型PCOS 的关键靶点包括STAT3、JUN、AKT1、MAPK3、MAPK1、MAPK14、IL-6、MAPK8、FOS、EGFR 和ESR1，见图3C，图3D。其中，STAT3、JUN、AKT1、MAPK3、MAPK1、MAPK14、IL-6 和FOS 是二者共有靶点，表明这8 个靶点可能是二陈汤治疗肥胖型不孕和肥胖型PCOS“异病同治”的关键靶点。

图3 蛋白相互作用网络图

2.5 GO 与KEGG 富集分析

为了进一步探究二陈汤“异病同治”的作用机制，利用Cytoscape 3.7.1 进行二陈汤治疗肥胖型PCOS 和肥胖型不孕细胞对激素刺激的应答、细胞对有机环状化合物的应答等生物过程有关；二陈汤治疗肥胖型PCOS 主要与细胞运动的调节、细胞对有机环状化合物的应答、对凋亡过程的调节等生物过程有关，见图4，可见，二者具有相同的生物过程。KEGG 富集分析结果显示，二陈汤治疗肥胖型PCOS 的靶点主要富集在AGE-RAGE 信号通路、IL-17 信号通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂抵抗、内分泌抵抗等通路；二陈汤治疗肥胖型不孕的靶点主要富集在AGE-RAGE 信号通路、IL-17 信号通路、内分泌抵抗、HIF-1 信号等通路，见图5。AGE-RAGE 信号通路见图6，其中蓝色是二陈汤治疗肥胖型不孕的靶点，红色是二陈汤治疗肥胖型PCOS 的靶点。综上可见，二陈汤治疗这两种疾病对应的靶点参与的生物过程与信号通路既存在相似性，也存在差异性，为二陈汤“异病同治”提供了理论依据。

图4 GO 富集分析

图5 KEGG 富集分析

图6 AGE-RAGE 信号通路图

2.6 分子对接结果

活性成分靶点网络图显示：度值较高的成分包括槲皮素、山奈酚、柚皮素、黄芩苷和刺芒柄花素，其CAS 号分别为：117-39-5、520-18-3、480-41-1、21967-41-9 和485-72-3。蛋白互作网络图结果显示STAT3 为度值最高的蛋白质，但由于槲皮素、山奈酚等和STAT3 的对接结果已被报道[6-7]。因此，本研究选择JUN 蛋白作为对接受体，其PDB 数据库ID 为4y46，将活性成分与蛋白质进行分子对接，结果显示刺芒柄花素的结合能最强，为−6.02 kcal/mol，其次为柚皮素，结合能为−5.41 kcal/mol，山奈酚、黄芩苷、槲皮素的结合能类似，分别为−5.17 kcal/mol、−5.15 kcal/mol 和−5.11 kcal/mol，对接模式见图7。

图7 槲皮素(A)、黄芩苷(B)、刺芒柄花素(C)、山奈酚(D)和柚皮素(E)与JUN 对接模式图

3 讨论

二陈汤中以半夏为君，其性温燥重在化痰；陈皮理气，治痰先治气，与半夏相须为用；茯苓为佐，重在健脾渗湿，因“脾为生痰之源”；甘草为使，合诸药而解百毒，四药合用，共奏燥湿化痰之功。现代研究表明，加味二陈汤可以改善肥胖型PCOS 患者卵巢多囊样改变、内分泌功能以及糖脂代谢[8]；还可帮助肥胖型不孕患者受孕[9]。二陈汤对肥胖型PCOS 与肥胖型不孕均具有明显疗效，本研究采用网络药理学的方法对二陈汤“异病同治”进行探讨。

本研究表明槲皮素、山奈酚、柚皮素、黄芩苷等为二陈汤关键的活性成分，这些活性成分均属于黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、调节免疫等作用。现代研究表明，槲皮素可以明显降低肥胖型PCOS 患者睾酮（T）与黄体生成素（LH）水平[10]，从而改善PCOS 高雄激素状态并促进患者排卵；槲皮素还可以使不孕症患者芳香化酶表达降低[11]，帮助患者排卵受孕。黄芩苷可以通过抑制炎症反应下调caspase-3 减少颗粒细胞凋亡[12]，抑制活性氧产生减少卵母细胞凋亡[13]，发挥治疗作用。山奈酚对于肥胖型PCOS 和肥胖型不孕亦具有改善作用，山奈酚是一种天然的孕酮受体调节剂，可以在体内外激活孕酮受体信号[14]；同时山奈酚改善胰岛素抵抗可以调控肥胖型PCOS 患者的糖脂代谢[15]。

从靶点上看，STAT3、JUN、AKT1、MAPK3、MAPK1、MAPK14、IL-6 和FOS 是二陈汤“异病同治”的关键靶点，以STAT3、JUN、MAPK1 最为重要。STAT3 在细胞的生长与死亡中起到关键作用，其主要受到细胞因子和生长因子的调节。IL-6 是一种细胞因子，在IL-6 的作用下可以使STAT3磷酸化激活，从而介导下游的细胞生物过程。研究表明当归水提物可以降低p-STAT3 从而降低激素水平与炎症反应[16]；肌醇可以通过降低p-STAT3改善卵巢组织的胰岛素抵抗状态[17]。也有研究表明右归胶囊可以通过JAK2/STAT3 通路改善高龄不孕患者的体外受精结局[18]。可见，STAT3 是二陈汤“异病同治”的关键靶点。MAPKs 是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者，能被不同的细胞外刺激，如细胞因子、神经递质、激素等激活，MAPK/ERK 途径的异常激活，导致胰岛素信号传导系统破坏，进而出现胰岛素抵抗[19]。左归丸可以通过抑制MAPK/ERK 通路中相关重要因子的基因表达，改善PCOS 大鼠的胰岛素抵抗和卵巢多囊样改变[20]；补肾化痰法可以经APN/p38MAPK 信号通路，改善肥胖型PCOS 的糖脂代谢紊乱[21]。JUN是MAPK 信号通路中的重要分支，它在细胞周期、生殖、凋亡、细胞应激等多种生理和病理过程中发挥重要作用。研究表明，脱氢表雄酮下调尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）/uPAR 通过JNK 信号通路提高p-c-Fos、p-c-Jun 的表达，促进滋养层细胞迁移和侵袭，改善卵巢功能，从而起到治疗PCOS 型不孕的作用[22]。

GO 与KEGG 富集分析表明，二陈汤“异病同治”的靶点主要富集在炎症、糖脂代谢、内分泌等信号通路。最新医学研究显示，PCOS 是一类慢性炎症相关性疾病，这种炎症不同于细菌或病毒感染的急性炎症，是一种长期存在的免疫性炎症，通常以IL-6、CRP、TNF-α 等水平反映机体的免疫状态[23]。目前研究普遍认为当机体处于炎症状态时，炎症因子水平增加并激活几条重要的炎症信号通路，例如JAK-STAT 信号通路、MAPK 信号通路以及NF-kBp65 信号通路等，这些炎症信号通路与胰岛素信号通路之间通过交叉对话促使胰岛素受体底物-1（INS-1）、INS-2 等分子的表达或活性受到抑制，诱导胰岛素抵抗的产生[24]；而胰岛素抵抗又进一步通过抑制胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1）基因转录或抑制肝脏性激素结合球蛋白（SHBG）合成等途径刺激雄激素合成信号转导亢进，最终导致高雄激素血症的产生。

综上所述，网络药理学结果表明，二陈汤“异病同治”肥胖型PCOS 与肥胖型不孕的成分主要包括槲皮素、山奈酚、黄芩苷，“异病同治”的靶点为STAT3、JUN、AKT1、MAPK3、MAPK1、MAPK14、IL6 和FOS，炎症通路、糖脂代谢通路、内分泌通路是二陈汤异病同治的关键因素，这为中医药治疗慢性低度炎症，改善胰岛素抵抗，调整月经周期提供了理论依据。