12种抗菌药物抗大肠埃希氏菌的增效剂筛选试验

陈宇微，高 琛，杨志远,王金泉,刘畅,3，郝智慧*

(1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052;2.中国农业大学动物医学院中兽医药创新中心，北京 100193;3.青岛农业大学化学与药学院，山东青岛 266109)

抗菌药物是目前我国畜牧养殖行业中使用最广泛和最重要的抗感染药物，在控制畜禽的传染性疾病和提高畜禽的生产性能方面发挥着重要作用。但如果使用不当，出现滥用等现象，会给畜禽及整个养殖业带来细菌耐药以及药物残留等诸多问题[1]。如今，细菌耐药问题在全球范围内普遍存在，多药耐药菌及全耐药菌的检出率居高不下，一些常用抗菌药物因为细菌耐药问题变得不敏感，而新药研发进程缓慢，寻找抗菌药物的抗菌增效剂增加或增强或增敏其疗效，能够减少临床抗菌药物的使用量，提高抗菌药物的使用效率已成为当前流行的应对策略[2-4]。目前已有大量通过抗菌药物协同抗生素联合抗菌的研究报道，如黄芩苷和环丙沙星、肉桂精油与氯霉素组合均对大肠埃希氏菌具有协同抑菌作用，且肉桂精油、玫瑰花精油、天竺葵精油等与链霉素、庆大霉素联用对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌有协同或相加作用[5-7]。笔者通过针对临床常用的12种抗菌药物的抗大肠埃希氏菌增效剂进行筛选，以丁香酚、尼泊金酯钠、羧甲壳聚糖、没食子酸酯和乙基麦芽酚5种可能的成分为目标，确定其作为抗菌药物针对大肠埃希氏菌的抗菌增效剂的可能性，期望能够筛选出与抗菌药物配伍使用具有较好的协同或相加增效的抗菌增效剂。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 没食子酸甲酯、没食子酸乙酯，成都瑞芬思生物科技有限公司产品；丁香酚、尼泊金酯钠、羧甲壳聚糖、没食子酸酯、没食子酸丙酯、乙基麦芽酚等增效剂候选药物及抗菌药物，山东信德生物科技有限公司赠送。抗菌药物信息见表1。

表1 抗菌药物信息

1.1.2 菌株来源 大肠埃希氏菌质控菌株ATCC 25922，购自中国工业微生物菌种保藏中心。

1.1.3 培养基 LB琼脂、MH肉汤，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司产品。

1.1.4 仪器 双人单面垂直净化工作台(SW-CJ-2FD)，苏州净化设备有限公司产品；生化培养箱(LRH-250F)、恒温振荡培养器(HZQ-X300C)，上海一恒科学仪器有限公司；自动立式高压灭菌器(GI80DS)，致微(厦门)仪器有限公司；十万分之一电子天平(BT125D)，赛多利斯公司产品。

1.2 方法

1.2.1 抗菌药物的配制 以少量的溶剂(100 μL)溶解抗菌药物及单体，再用稀释剂稀释终浓度含10 mL/L溶剂，配制终浓度为5 120 μg/mL药物储备液，用0.22 μm滤膜过滤除菌后分装到无菌2 mL离心管中，置-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 菌液的制备 用过夜培养的MH琼脂培养皿上的单菌落，制备0.5麦氏浊度菌悬液，用无菌MH肉汤100倍稀释，即得到约含1.0×106CFU/mL的菌液。

1.2.3 大肠埃希氏菌MIC测定 采用微量肉汤稀释法进行测定[8]。

1.2.4 联合药敏试验(FIC测定) 将各种药物原液从2倍MIC浓度开始，取6个～8个浓度梯度使用灭菌MH肉汤倍比稀释。取无菌96孔板，采用棋盘法，将不同浓度的2种药物各取50 μL分别排列在96孔板的横列和纵列中形成不同浓度组合的2种药物混合液。在加药的96孔板中每孔加入100 μL稀释好的1.0 × 106CFU/mL大肠埃希氏菌悬液，混匀后置于37 ℃培养箱中培养14 h～16 h后观察结果。

1.2.5 抑菌浓度指数FIC值计算 联合药敏试验结果浓度指数作为联合药敏试验的判断依据，计算公式如下：

其中,FIC≤0.5为“协同作用”；0.5

2 结果

2.1 12种临床常用抗菌药物对大肠埃希氏菌体外抑菌MIC结果

通过观察96孔板中培养物的透明度，根据试验结果得出庆大霉素、多西环素、金霉素、青霉素V、红霉素、乳酸恩诺沙星、林可霉素、氟苯尼考、泰妙菌素、阿莫西林、壮观霉素、黏杆菌素的MIC值分别为1、8、128、128、512、512、2 560、4、256、4、0.312 5、0.125 μg/mL。

2.2 抗菌增效剂候选物对大肠埃希氏菌的体外抑菌试验MIC结果

通过观察96孔板中培养物的透明度，计算出8种单体的MIC，可知丁香酚、尼泊金酯钠、羧甲壳聚糖、没食子酸酯、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、没食子酸丙酯和乙基麦芽酚对大肠埃希氏菌均有抑制作用，丁香酚、尼泊金酯钠、羧甲壳聚糖、没食子酸酯、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、没食子酸丙酯和乙基麦芽酚对大肠埃希氏菌的MIC值分别为256、256、2、640、512、512、512、5 120 μg/mL。

2.3 联合作用比较

2.3.1 丁香酚与抗菌药物联合作用 由表2可知，丁香酚与庆大霉素、金霉素、乳酸恩诺沙星、林可霉素、氟苯尼考、泰妙菌素、黏杆菌素联合作用均具有协同作用，其中丁香酚与金霉素的协同作用最强。丁香酚与红霉素联用具有相加作用；与多西环素和壮观霉素联用呈无关作用而与青霉素V和阿莫西林具有拮抗作用。

2.3.2 尼泊金酯钠和抗菌药物联合作用 由表2的结果可以看出尼泊金酯钠与金霉素、乳酸恩诺沙星、林可霉素、氟苯尼考、泰妙菌素均具有协同作用，其中尼泊金酯钠与氟苯尼考的协同作用最强。尼泊金酯钠与庆大霉素、多西环素、红霉素、阿莫西林、黏杆菌素联用具有相加作用；与壮观霉素具有无关作用而与青霉素V具有拮抗作用。

2.3.3 羧甲壳聚糖和抗菌药物联合作用 由表2的结果可以看出羧甲壳聚糖与庆大霉素、多西环素、红霉素、乳酸恩诺沙星、林可霉素、氟苯尼考、泰妙菌素均具有协同作用，其中羧甲壳聚糖与乳酸恩诺沙星的协同作用最强。羧甲壳聚糖与金霉素、青霉素V、阿莫西林、壮观霉素联用具有相加作用；与黏杆菌素具有无关作用。

2.3.4 没食子酸酯和抗菌药物联合作用 由表2可知，没食子酸酯与多西环素、金霉素、红霉素、乳酸恩诺沙星、林可霉素、氟苯尼考、泰妙菌素均具有协同作用，其中没食子酸酯与林可霉素的协同作用最强。没食子酸酯与壮观霉素和黏杆菌素联用具有相加作用；与青霉素V、阿莫西林、和壮观霉素具有无关作用,而没食子酸酯与庆大霉素联用具有拮抗作用。

2.3.5 乙基麦芽酚和抗菌药物联合作用 由表2的结果可以看出乙基麦芽酚与庆大霉素、多西环素、金霉素、红霉素、乳酸恩诺沙星、林可霉素、泰妙菌素均具有协同作用，其中乙基麦芽酚与金霉素的协同作用最强。乙基麦芽酚与壮观霉素和黏杆菌素联用具有相加作用。

表2 抗菌增效剂和抗菌药物联用指数(FIC)结果

3 讨论

本研究所选取的氟苯尼考等12种抗菌药物都是临床大肠杆菌病常用抗菌药物，都存在着一定程度的耐药性问题，在临床实践中已有发现大肠埃希氏菌对青霉素和红霉素不敏感的现象[9]，甚至部分鸡场还检测到对青霉素耐药的情况，同时禽致病性大肠埃希氏菌对金霉素也有严重的耐药性[10]。除此之外，猪源大肠埃希氏菌对金霉素、多西环素等四环素类抗菌药物均有着严重的耐药性[11]，临床调查发现猪源肠球菌对氟苯尼考也出现了耐药性[12]。不仅国内有大肠埃希氏菌对抗菌药物耐药的报道，国外也有研究发现大肠埃希氏菌已出现明显的耐药性[13]。因此，在抗菌药物耐药性日益严重的情况下，解决抗菌药物的耐药性问题就显得非常重要。研究表明恩诺沙星和庆大霉素与中药单体联用对仔猪大肠埃希氏菌引起的腹泻比单药使用有更高的治愈率[14]，说明恩诺沙星和庆大霉素等抗菌药物在与增效剂联用的情况下能明显的增强抗菌药物疗效，而硒化甘草多糖联合抗菌药物的研究也表明中药单体能够减少抗菌药物的使用剂量[15]。同时，国外研究者发现精油等化合物与抗菌药物联用具有协同作用[16]，也证实了中药单体作为增效剂的可行性。通过MIC检测发现丁香酚、尼泊金酯钠、羧甲壳聚糖、没食子酸酯和乙基麦芽酚等抗菌增效剂候选物均有一定的抑菌作用，且与所针对的抗菌药物联用具有很好的协同或相加作用。本文所选的丁香酚所展现的抑菌作用与钱卫东等[17]研究发现的抗菌活性相一致。尼泊金酯钠常用作食品防腐剂，其抑菌作用与邓明玉等[18]对尼泊金酯抑菌性能的研究相符，表明尼泊金酯钠不仅仅可以用作防腐剂，也可以考虑与抗菌药物联用减轻抗菌药物的用量。众所周知，壳聚糖具有抑菌作用，常用于对织物进行抑菌防霉整理和在食品行业作为天然保鲜剂[19]。本试验结果发现壳聚糖衍生物羧甲壳聚糖也具有抑菌作用，且其对大肠埃希氏菌的抑制效果突出。没食子酸盐类物质的抑菌作用已被多数研究者进行报道，本试验发现没食子酸酯也具有抑菌效果，且能够和多西环素、金霉素、红霉素、乳酸恩诺沙星、林可霉素、氟苯尼考、泰妙菌素等抗菌药物具有很好的协同抑制大肠埃希氏菌作用。乙基麦芽酚是一种安全、可靠、用量少、效果显著的食品添加剂，常被用于食品的增甜效果。乙基麦芽酚对大肠埃希氏菌具有抑菌作用，但是相比其他的单体其抑制作用较弱。然而，乙基麦芽酚具有很好的联合性，与多种抗菌药物联用对大肠埃希氏菌均有较强的抑制作用，且其与庆大霉素、多西环素、金霉素、红霉素、乳酸恩诺沙星、林可霉素、泰妙菌素的FIC指数差异不大，与乙基麦芽酚的协同抑菌机制是否有关还需要进一步的研究。

根据FIC指数发现同一单体对不同类型抗菌药物的协同抑菌作用具有较大的差异。如丁香酚与黏杆菌素，尼泊金酯钠与林可霉素，羧甲壳聚糖与多西环素，乙基麦芽酚与阿莫西林的FIC指数均显著高于同一单体与其他抗菌药物联用的FIC指数。可能与不同类型抗菌药物的作用机制有关，抗菌药物的抑菌机制不同，从而引起单体的增效机制不同，这一发现还需要进一步的试验进行验证。且同一抗菌药物对不同单体的联合作用也有明显差异。如阿莫西林与丁香酚联用时具有拮抗作用，与没食子酸酯联用具有无关作用，而与尼泊金酯钠和羧甲壳聚糖联用则具有相加作用，与乙基麦芽酚联用则具有协同作用。因此，不同单体对不同的抗菌药物的协同或相加作用的作用机理是非常值得探讨的。

丁香酚、尼泊金酯钠、羧甲壳聚糖、没食子酸酯、乙基麦芽酚均具有较好的增效作用。丁香酚与检测的12种抗菌药物中8种抗菌药物具有协同或相加作用；尼泊金酯钠与检测的12种抗菌药物中的10种具有协同或相加作用；羧甲壳聚糖与检测的12种抗菌药物中的11种具有协同或相加作用；没食子酸酯和乙基麦芽酚分别与检测的12种抗菌药物中的9种、12种具有协同或相加作用。5种增效剂均与金霉素、乳酸恩诺沙星、林可霉素、泰妙菌素有协同作用。丁香酚、尼泊金酯钠、羧甲壳聚糖、没食子酸酯、乙基麦芽酚可以作为抗大肠埃希氏菌类抗菌药物的抗菌增效剂使用，在临床抗菌药物联合选择中优先被考虑，降低抗菌药物在临床抗大肠埃希氏菌感染的用量。