东北虎源猫免疫缺陷病毒pol基因遗传进化分析

刘恩琪，马丽莹，黄舒萍，尤 丹，郭立君，刘 丹，徐海涛，郜 旭，王亚君*

(1.东北林业大学野生动物与自然保护地学院，黑龙江哈尔滨 150040；2.黑龙江东北虎林园，黑龙江哈尔滨 150028；3.黑龙江边防检查总站哈尔滨警犬训练基地，黑龙江肇东 151121)

猫获得性免疫缺陷综合征(Feline acquired immu-nodeficiency syndrome,FAIDS)是由猫免疫缺陷病毒(Feline immunodeficiency virus,FIV)感染引起的主要侵害猫科动物免疫系统，进而导致其他细菌、病毒的继发感染，最终造成动物死亡的一种慢性接触性传染病。由于它在基因组、生化特性、致病机制等方面均与人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)相似，故也称为猫艾滋病，临床常把FIV作为HIV研究的动物模型[1-2]。FIV广泛分布于全世界，自然情况下可感染20多种猫科动物[3-6]，基因组全长约为9 500 bp，包括3个主要的开放阅读框gag、pol和env，通过env基因的V3-V5高变区可将FIV分为7种亚型(A、B、C、D、E、F和U-NZenv)；此外，研究表明gag基因也能证实亚型A-E[7-8]。

东北虎是世界上体型最大的猫科动物之一，由于数量稀少已被国际自然保护联盟确认定为濒危物种[9]。目前，国内关于FIV的研究十分有限，东北虎因为样本采集难度大，全球可获取到的虎源FIV序列也仅有1个450 bp的gag基因片段和1个505 bp的pol基因片段[4]。通过本研究，不但可以为东北虎FIV监测提供技术支持，还可以丰富猫科动物FIV流行病学数据库，为野生猫科动物FIV进一步研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源与储存 黑龙江省海林市横道河子东北虎林园东北虎全血50份，置于-80 ℃储存。

1.1.2 主要试剂 Baypure通用型磁珠法病毒DNA/RNA快速提取试剂盒，广州湾区生物科技有限公司产品；1.1×T3 Super PCR Mix，北京擎科新业生物技术有限公司产品；RNase抑制剂、DNA标准DL 2 000，宝日医生物技术(北京)有限公司产品；M-MLV逆转录酶，Promega公司产品；DEPC水、琼脂糖、TAE(50×)溶液、核酸染料GoldView，Biosharp公司产品。

1.1.3 仪器设备 微量移液器，Eppendorf公司产品；生物安全柜，上海力辰邦西仪器科技有限公司产品；BBEX-32核酸提取仪，广州湾区生物科技有限公司产品；MK-20干式恒温器，杭州奥盛仪器有限公司产品；SEDI热循环仪、GES水平电泳槽、ELITE 300 Plus电泳仪电源，Wealtec公司产品；ZF-4型紫外透射仪，上海光豪分析仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 核酸的提取与反转录 按照Baypure通用型磁珠法病毒DNA/RNA快速提取试剂盒的说明书从全血中提取病毒核酸。将4 μL随机引物加入含有核酸的无RNA酶的EP管内，并置于干式恒温器70 ℃培养5 min，再放入-20 ℃冰浴5 min。之后向EP管加入10 μL M-MLV 5×buffer、8 μL dnTP、 6 μL DEPC水、1 μL M-MLV逆转录酶和RNase抑制剂，于37 ℃培养1 h后继续-20 ℃冰浴5 min，并置于-20 ℃储存。

1.2.2 套式PCR 根据参考文献[3]，选择pol基因的P3F- P5R和P4F-P4R引物进行套式PCR，引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。PCR反应体系为：1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL，cDNA 1 μL，上游引物(P3F/P4F)和下游引物(P5R/ P4R)各1 μL，总体积为25 μL。扩增程序如下：98 ℃预变性2 min；98 ℃ 10 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR产物凝胶电泳并测序。

1.2.3pol基因片段序列分析 将所测序列与同源序列对比分析，选取同源性最高的前15个毒株的序列作为对应病毒基因的参考序列(表1)；并运用DNA Star 11软件的MegAlign程序对所测序列进行同源性及氨基酸突变位点分析；再利用MEGA-X软件构建进化树。

表1 FIV pol基因参考毒株

续表1

2 结果

2.1 扩增与测序结果

通过套式PCR技术，从50只东北虎的全血检测出1株FIV 阳性(命名为HD631)，扩增出的pol基因片段大小与预期相符，表明该样本为FIV阳性，电泳结果见图1。

M.DNA 标准DL 2 000;1.PCR产物

2.2 同源性分析

HD631毒株与参考毒株pol基因的核苷酸、氨基酸同源性分别为70.0%～99.8%和75.0%～99.4%；且与CHN17毒株的核苷酸、氨基酸同源性最高(图2)。其中，2株C亚型猫源FIV毒株与狮源FIV毒株核苷酸同源性较A亚型猫源FIV毒株、HD631毒株高，而氨基酸同源性结果相反。

图2 FIV pol基因核苷酸序列同源性分析

2.3 氨基酸突变位点分析

经剪切对齐后，HD631毒株和参考毒株的pol基因部分核苷酸序列长为504 bp，编码168个氨基酸；其中Ple-915毒株缺失1个碱基(第191位)。由表2可知，HD631毒株与参考毒株共存在39个氨基酸突变位点，可大致分为3类，确定的氨基酸突变情况(3个)、不确定的氨基酸突变情况(32个)及氨基酸存在多态性(4个)；其中，第2种情况是指不能确定该氨基酸突变的物种来源。

表2 FIV pol基因编码氨基酸突变位点分析

2.4 遗传进化分析

由图3可知，FIVpol基因部分核苷酸序列与国内外参考序列对比分析，系统进化树分为两个大分支。就物种而言，HD631毒株与猫源FIV毒株处于同一分支，而与狮源FIV毒株处于另一分支。就亚型而言，HD631毒株与以A亚型毒株亲缘关系最近，与C亚型毒株亲缘关系稍远，与B亚型毒株亲缘关系最远。

●代表本研究鉴定的FIV毒株

3 讨论

研究结果显示，HD631毒株也与CHN17毒株具有最高的核苷酸、氨基酸同源性，分别为99.8%和99.4%；且系统发育树显示该毒株与猫源FIV毒株亲缘关系较近，其与A亚型同源性在93%以上、与C亚型同源性在81%以上，而与狮源FIV毒株亲缘关系较远，同源性为70.2%～73.0%。由于该毒株匹配到了两个物种的同源序列，因此其氨基酸突变位点多达39个；其中Ple-915毒株缺失第191位碱基，翻译得到的氨基酸数较其他毒株少1个，但不影响结果的分析。就本结果而言，可以确定突变氨基酸的有3个位点，分别是第45、79、162位；氨基酸存在多态性的有4个位点，分别是第32、34、49、56位；剩下的32个位点不确定氨基酸突变来自猫源还是狮源。有趣的是，尽管C亚型猫源FIV毒株与狮源FIV毒株氨基酸同源性较A亚型猫源FIV毒株、HD631毒株低，但C亚型毒株在部分氨基酸突变中与狮源毒株保持一致。此外，在氨基酸突变位点的分析中也验证了HD631毒株与CHN17毒株的高度一致性，两者几乎在所有突变位点中都为同一种氨基酸。由于这些结果是针对于不同物种分析的，且参考毒株数量有限，可能上述氨基酸在虎这个物种并不存在突变，这一推测还需要获得更多不同地区不同样本的该基因序列进行验证。

在众多关于家猫的FIV研究中均以env基因的V3-V5高变区鉴定病毒亚型，但在大型猫科动物(如狮子、美洲狮等)中则以高度保守的pol基因进行分型，且pol基因的遗传进化分析显示出具有物种特异性[5,8,10]。因此，老虎FIV的亚型鉴定可能也是由pol基因决定的。上述结果显示，HD631毒株的pol基因核苷酸、氨基酸序列与所有A亚型的猫源FIV毒株同源性分别高达94%、92%以上；而与两株C亚型的猫源FIV毒株的同源性仅有70%～80%。因而推测HD631毒株可能为A亚型。鉴于本试验的结果和家猫、流浪猫中慢病毒感染的高发病率，很有必要对我国圈养东北虎、动物园流浪猫及其他圈养猫科动物进行FIV检测，以获取足够的数据，便于对FIV进一步研究。