基于CRISPR/Cas12a快速识别apxIVA的胸膜肺炎放线杆菌检测平台的建立

胸膜肺炎放线杆菌是引起猪急性呼吸道感染的重要病原菌之一，以急性出血性肺炎和慢性坏死性胸膜肺炎为主要特征。随着我国集约化、工业化养猪模式的不断发展，以及饲料中禁止添加抗生素政策的实施，都给该细菌性疾病的防控提出了新的挑战。一旦猪只感染此病，生长发育速度变缓，饲料利用率变低，日增重及免疫抵抗力降低，其他生产性能也明显下降，给世界养猪业造成了严重的经济损失。

胸膜肺炎放线杆菌是革兰氏阴性球杆菌，可以产生毒素。不同血清型分泌的外毒素种类不同，导致其毒力差异。已有研究表明现在分离鉴定的19 种血清型均可分泌毒素ⅠV 蛋白（ApxⅠV）。因此，apxⅠ-VA 基因也被认为是APP 感染临床诊断的理想检测靶点。对于APP 感染的鉴定，通常使用传统的分离培养和分子生物学方法，而分离培养法相对耗时，因此人们更倾向于使用PCR 和qPCR 等分子生物学方法。但是，这两种实验室的常规技术，不仅要求昂贵的仪器设备，还需要操作熟练的专业技术人员，这给现地开展快速检测带来了一定的不便。

近期发表于《Frontiers in Microbiology》的“A CRⅠSPR/Cas12a-assisted rapid detection platform by biosensing the apxⅠVA ofActinobacillus pleuropneumoniae”一文介绍了一种快速识别胸膜肺炎放线杆菌核酸的快速检测平台，该方法将重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRⅠSPR/Cas12a 快速识别系统相结合，并可依据检测人员具备的硬件条件，通过3 种方法进行结果的判定，最终实现APP 感染的快速检测。

RPA 反应依赖于多个酶的互相协同作用，反应过程无需精密的仪器设备，仅需要一台恒温设备（金属浴或水浴锅）在37 ℃～42 ℃下，即可完成对目标序列的指数扩增。CRⅠSPR/Cas12a 检测系统主要是利用crRNA 引导的Cas12a 识别靶序列后激活的Cas12a 非特异性切割单链DNA（ssDNA）活性，当体系中两端分别由荧光基团和淬灭基团修饰的ssDNA被切割后，即可释放出荧光，进而实现快速检测。整个检测过程可以在1 h内完成。自从2018年Doudna 团队 首 次 使 用CRⅠSPR/Cas12a 进 行HPV 的 快 速 检测后，已有多个团队开发出针对不同种人类和动物病原的快速检测平台，如Cas12aVDet、OCTOPUS 等。

该研究通过对crRNA、RPA 引物设计及筛选得到最佳检测体系之后，以APP 现有的19 种血清型参考菌株和7 种常见的猪病病原和巴氏杆菌属内的8种与APP 亲缘关系较近的菌种的基因组为模板，进行了特异性分析，结果表明其对APP 具有高度特异性，没有发现对其它病原的交叉污染；同时通过使用人工构建的载体和菌体进行了灵敏度的分析，结果显示其最低检出量为10 cfu/反应，与实验室常用的qPCR 方法具有相似的灵敏度。而对于实验室早期保存的肺脏样品检测时，表现出与传统PCR 法高度的一致性。同时，在结果读取时其可以在蓝光仪激发条件下直接通过肉眼观察，也可以通过酶标仪进行荧光值测定或使用免疫层析试纸条直接观察。以上读取方式的选择，一方面取决于检测人员现有的实验条件，另一方面也需要结合检测样本的数量。尽管现阶段其单次检测成本高于常用的分子生物学方法，但对于满足现场以及条件匮乏地区的APP 感染快速鉴定，无疑提供了一种候选方案。