B亚型禽偏肺病毒对商品肉鸡的致病性研究

冯笑艳，包媛玲，于蒙蒙，孟令宅，刘 鹏，王素艳，李欣翼，张 卓，张艳萍，刘长军，王笑梅,2，高玉龙*

（1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150069；2.扬州大学江苏动物重要疫病与人畜共患病协同创新中心，江苏 扬州 225009）

禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus，aMPV）属于副黏病毒科、肺病毒亚科、偏肺病毒属成员[1]。aMPV于1978 年首次在南非被发现并报道，随后在全球范围内流行。根据编码G 基因的核苷酸序列差异和血清中和交叉反应，将aMPV 分为A、B、C 和D 等4 个亚型[2]，其中A和B亚型aMPV 流行范围广，世界多地均有报道，C 亚型aMPV 在美国、韩国、加拿大、中国等地有报道，D亚型仅在法国被检测到[3]。

aMPV 的自然宿主是鸡和火鸡，其次是鸭、鹅及野生迁徙鸟类。aMPV 感染火鸡引起火鸡的鼻气管炎（Turkey rhinotracheitis，TRT）；感染蛋鸡导致产蛋量下降，软壳蛋和薄壳蛋增多，若伴有上呼吸道症状时会引起母鸡子宫脱落；感染肉鸡则引起肿头综合征（Swollen head syndrome，SHS），主要表现为：泡沫性结膜炎、流涕、流泪、下颌水肿和眶下窦肿胀[4]；感染野生鸟类临床症状不明显，但其可充当宿主携带并传播病毒[5]。aMPV 单一感染死亡率较低，但若与新城疫病毒、传染性支气管炎病毒或细菌发生混合感染，将加重病情导致较高的死亡率。另外，aMPV感染会引起蛋鸡产蛋率、孵化率等生产性能下降及肉鸡肉质、增重比及饲料转化率等关键生长性能指标下降[6]，造成严重的经济损失。

我国首次于1998年报道了aMPV，随后的血清学调查和病原学调查结果显示，黑龙江、吉林、新疆、湖北、河北等多地肉鸡中普遍存在B 亚型aMPV 的感染，且流行范围越来越广[7-8]。但关于B 亚型aMPV 对肉鸡的致病性研究鲜有报道，本研究将本实验室前期分离的B 亚型aMPV LN16 株[9]通过滴鼻的方式接种21日龄的商品肉鸡，系统分析了B 亚型aMPV 对肉鸡的致病性，为养殖场aMPV病的诊断及防控提供指导。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料B 亚型aMPV LN16 株由本实验室分离、鉴定并保存[9]。Vero细胞由本实验室保存。1日龄商品肉鸡购自国内某商品肉鸡场。RNAiso plus、10×PCR Buffer（Mg2+Plus）、dNTP Mixture（2.5 mmol/L）TaKaRaTaqTMHot Start 均购自宝生物工程（大连）有限公司；反转录试剂HiScriptⅡQ RT SuperMix for qPCR购自南京诺唯赞有限公司；aMPV 抗体检测试剂盒为美国IDEXX公司产品。

1.2 引物、探针的设计与合成参考文献[9,10]B亚型aMPV LN16 株序列，设计荧光定量RT-PCR 引物及探针，其中荧光定量RT-PCR 引物由吉林库美生物科技有限公司合成，特异性TAMRA 标记的B 亚型aMPV探针由金斯瑞生物科技股份有限公司合成（表1）。

表1 B亚型aMPV荧光定量RT-PCR检测引物Table 1 B subtype aMPV qRT-PCR detection primers

1.3 肉鸡的分组、感染与临床症状的观察将24 只21 日龄肉鸡（母源抗体检测均为阴性）随机均分为感染组和空白组，感染组采用滴鼻的方式接种5×103TCID50/只（200 μL）LN16 株病毒液，空白组不做处理，分别饲养于不同的负压隔离器内，在7 d 的观察期内观察记录感染组和空白组鸡临床症状，并于感染后1 d～7 d内每日采集鼻腔拭子。

1.4 肉鸡排毒的荧光定量PCR 检测将采集的鼻腔拭子于600 μL 无菌PBS 震荡混匀20 s，4 ℃300×g 离心5 min，取200 μL 上清采用TRIzol 法提取RNA，采用反转录试剂盒制备cDNA，以其为模板，采用文献[10]中荧光定量RT-PCR 检测感染肉鸡排毒情况，并计算样品中病毒拷贝数。

1.5 病毒在肉鸡各组织分布的荧光定量PCR 检测感染后第4 d 于感染组和空白组中分别随机取3 只鸡，心脏采血后取鼻甲骨、肺脏、气管、哈氏腺各0.1 g，研磨后采用TRIzol 法提取RNA，采用荧光定量RT-PCR[10]检测病毒在肉鸡各组织的分布情况。

1.6 肉鸡血清抗体的检测感染后1 d～21 d，每经7 d 翅下采集各组肉鸡的非抗凝血，分离血清，利用aMPV 抗体ELISA 检测试剂盒检测各组鸡血清抗体变化情况。

1.7 肉鸡各组织病理学检测感染后第9 d，感染组和空白组各随机剖杀2 只鸡，取鼻甲骨、肺脏和气管于10%福尔马林内固定、常规方法包埋、制作石蜡切片、HE 染色后镜检观察各组织病理学变化。

1.8 数据的统计与分析实验数据利用GraphPad Prism 8 进行分析处理并作图。

2 结 果

2.1 肉鸡临床症状观察结果感染后1 d～7 d 每天观察各组鸡的临床症状，可见感染组鸡在感染后第3 d 开始出现流鼻涕、眼睛有泡沫等症状，从第4 d开始出现泡沫状和粘稠状鼻涕，第6 d 感染组鸡的发病率最高，症状也最明显，第6 d 和7 d 各有1 只鸡出现了鼻痂的症状；空白组鸡在观察期未见任何临床症状。感染组鸡感染后3 d～6 d 发病率逐渐升高，由33.3%（4/12）上升至83.3%（10/12），第7 d 开始降低，感染组累计发病率为100%（12/12）；空白组鸡无发病。表明商品肉鸡感染B 亚型aMPV 会出现明显的临床症状。

2.2 肉鸡排毒检测结果感染后1 d～7 d 每日采集感染组与空白组肉鸡的鼻腔拭子，利用荧光定量RTPCR 进行排毒检测，结果显示，感染组鸡在感染后1 d～3 d 鼻腔拭子中病毒拷贝数呈上升趋势，第3 d 达峰值（6.31×104拷贝/200 μL）后开始下降，并持续至第6 d，第7 d 检测不到排毒；空白组鸡未检测到排毒（图1）。表明商品肉鸡感染B 亚型aMPV 后排毒持续期为6 d，排毒高峰在感染后第3 d。

图1 排毒检测结果Fig.1 Viral shedding results

2.3 病毒在肉鸡各组织分布的检测结果感染后第4 d 各组随机剖杀3 只，采集脏器进行B 亚型aMPV 检测，结果显示，感染组肉鸡喉头、鼻甲骨病毒检出率均为100%，气管、哈式腺检出率为33%（1/3只），肺脏检出率为0；其中鼻甲骨的病毒拷贝数最高，达3.53×104拷贝/0.1 g，喉头次之，为1.87×104拷贝/0.1 g，哈氏腺和气管检出率相对较低，而肺脏中未检测到病毒；空白组鸡均未检测到病毒（图2）。表明商品肉鸡感染B亚型aMPV 后病毒主要存在于上呼吸道，其中鼻甲骨含量最高。

图2 病毒组织分布检测结果Fig.2 Detection of virus tissue distribution

2.4 肉鸡血清抗体水平检测分别于感染后7 d、14 d、21 d 对感染组和空白组肉鸡采血，分离血清后采用ELISA 试剂盒检测抗体水平，结果显示，感染后第7 d，感染组肉鸡均抗体转阳，随着时间推移，血清抗体水平逐渐升高。感染组肉鸡感染后第7 d、第14 d 和第21 d 的aMPV 抗体效价平均值分别为1∶3 665、1∶4 684和1∶8 202；而空白组肉鸡各时间点均未检测到aMPV 特异性抗体（图3）。表明商品肉鸡感染B 亚型aMPV 后7 d 抗体转阳，且抗体水平随时间推移呈上升趋势。

图3 各组鸡抗体水平检测结果Fig.3 Detection results of serum antibody

2.5 肉鸡组织病理学检测结果感染后第9 d，采集感染组和空白组肉鸡的鼻甲骨、气管和肺脏，制备病理切片并观察各组织病变，结果显示，感染组肉鸡鼻甲骨的鼻黏膜固有层有炎症性细胞及嗜酸性粒细胞浸润（图4A）；肺脏有淤血（图4B）；气管黏膜固有层内也存在较多炎性细胞浸润，黏膜上皮细胞部分变性或坏死（图4C）。空白组肉鸡各组织均未见明显的病理变化（图4D～图4F）。上述结果表明，B 亚型aMPV 感染能够引起商品肉鸡的呼吸器官发生不同程度的炎症反应，主要表现为炎性细胞浸润。

图4 各组鸡各组织病理学检测结果Fig.4 Histopathologic changes in tissues from aMPV LN16 infected chickens

3 讨 论

1998 年，我国首次报道了黑龙江某肉种鸡场感染aMPV[11]，随后aMPV 的血清学调查结果显示，我国辽宁、河北、山东、河南、江苏、吉林、湖北等地区的肉种鸡中均检测到aMPV 抗体，有的鸡场的血清抗体阳性率高达100%[8]。病原学调查结果显示，在江苏、山东、辽宁、河南、河北、黑龙江等地区的肉种鸡均检测到了B 亚型aMPV[7-8]，而A 亚型和C 亚型aMPV 仅在东南地区检测到，这表明B 亚型aMPV 在我国肉鸡群中为优势流行亚型[7,12]。但由于该病毒分离困难，aMPV 对肉鸡的致病性分析鲜有报道，本研究利用本实验室前期分离的B 亚型aMPV LN16 株感染商品肉鸡，从鸡的临床症状、鸡体排毒情况、病毒在鸡各组织中分布、血清抗体水平及部分器官组织病理学变化等方面系统的研究了B 亚型aMPV 对商品肉鸡的致病性，为后期肉鸡场B 亚型aMPV 感染的诊断及防控提供相应指导。

已有文献报道火鸡源B 亚型aMPV 感染16 日龄的肉鸡之后主要表现为：精神沉郁、流鼻涕、咳嗽和眶下窦肿胀，并且病程较长[13]。本研究中21 日龄的商品肉鸡感染鸡源B 亚型aMPV LN16 株后，在感染后3 d～6 d 也出现流鼻涕、鼻痂、眼睛有泡沫等明显的临床症状，且发病率可达100%，可见鸡源和火鸡源的B 亚型aMPV 对商品肉鸡的致病性基本一致。本研究中的感染组肉鸡未出现眶下窦肿胀，其可能的原因包括：1）感染实验均在隔离器里进行，无细菌混合感染；2）本研究的感染剂量较少，为5×103TCID50，有研究报道采用低于104TCID50感染剂量的火鸡源的B 亚型aMPV 也未成功复制出眶下窦肿胀的临床症状[13]。

本研究中肉鸡感染B 亚型aMPV 后的1 d～6 d 均可以检测到排毒，在第3 d 达到排毒高峰，这与前期在SPF 鸡和蛋鸡的研究结果一致，B 亚型aMPV 感染后的排毒期为1 d～6 d，排毒高峰期为感染后第2 d～4 d[9-10]。这些结果表明B 亚型aMPV 在不同品种鸡呼吸器官中的存活时间基本一致，均仅存活较短时间，无品种的差异性，这提示在诊断该病时应在临床症状初期采集鼻腔拭子进行病原检测或分离。

病原主要接触的鼻甲骨、喉头、气管、哈式腺、肺脏等部位是鸡抵御呼吸道感染的重要场所[12]，本实验中感染组商品肉鸡的喉头、鼻甲骨病毒的检出率达100%，说明该病毒在感染商品肉鸡后进入了喉头、鼻甲骨等器官，引起了流鼻涕等症状。

商品肉鸡在感染鸡源B亚型aMPV后7 d左右抗体开始转阳，随着时间的推移抗体效价有所升高[14]。分子流行病学调查数据也显示不同来源的B亚型aMPV G基因同源性较高，不低于93%[12,15]。上述实验数据均表明不同地区和不同种群分离的B 亚型aMPV 的生物学特性基本一致，因此推测鸡源B 亚型aMPV 可能来源于火鸡，这提示养殖场饲养中应避免混合饲养，以防止交叉感染。

商品肉鸡在感染鸡源B 亚型aMPV 后9 d 各组织的病理切片结果显示，商品肉鸡感染B 亚型aMPV 后上呼吸道出现不同程度的病理损伤，说明该病毒感染肉鸡后会对呼吸道器官造成损伤，引起局部炎症反应。

本研究表明，B 亚型aMPV 对商品肉鸡具有较强的致病性，主要临床症状为流鼻涕、眼睛有泡沫和鼻痂等症状。B 亚型aMPV 可以在感染肉鸡体内存活6 d左右，可造成鼻甲骨和气管的炎性细胞浸润，肺脏出血等病理性损伤。本研究首次揭示了商品肉鸡感染B 亚型aMPV 后的发病进程及发病规律，为肉鸡场B亚型aMPV 感染的诊断与防控提供了重要参考依据。