干扰CLDN6基因表达通过调控MAPK/ERK信号通路对多囊卵巢综合征大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响*

孙彩萍，张 丹，张 珂

(郑州大学第二附属医院 a.产科；b.生殖中心，郑州 450014)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)以月经稀发、高雄激素血症、卵巢多囊样改变为主要特征，影响全球5%～20%的育龄妇女[1-2]。PCOS会增加2型糖尿病、妊娠糖尿病、其他妊娠相关并发症、心脑血管事件、子宫内膜癌(endometrial cancer,EC)、卵巢恶性肿瘤等的风险[3]。颗粒细胞(granular cells,GC)是卵泡内卵母细胞周围的体细胞，对卵泡发生至关重要，在PCOS、卵巢早衰等卵巢疾病中均发现了GC的病理变化[4]。据报道，GC暴露于高水平雄激素下，相当于在PCOS中发现的雄激素，可导致卵泡进展停滞[5]。在小鼠PCOS模型中观察到卵泡数量增加和GC增殖[6]。此外，在PCOS女性卵巢中也观察到小卵泡中GC增殖上调[7-8]。因此，卵巢GC异常增殖可能在PCOS的发病机制中起作用，但其潜在机制仍不清楚。

Claudin-6(CLDN6)是紧密连接蛋白的一个组成部分，在几种类型的胚胎上皮细胞中表达，如小鼠胚胎干细胞、早期发育的上皮系细胞；在生殖细胞肿瘤中也高度表达，包括精原细胞瘤、胚胎癌、成熟畸胎瘤和典型精原细胞瘤，但在正常成人细胞中的表达不多[9]。CLDN6表达和分布在肿瘤组织中的失调与癌症进展相关。研究显示，在EC中CLDN6呈高表达，是EC患者的预后标记物，也是一个有希望的治疗靶点[10]；并且CLDN6在卵巢小细胞癌中也过度表达[11]。干扰CLDN6可抑制癌细胞生长并诱导细胞凋亡[12]；且CLDN6主要通过细胞凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase1,ASK1)-丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号通路促进癌细胞行为[13]。

MAPK/细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信号通路在PCOS的GC病理生理学中具有重要作用。ERK1/2可被排卵前卵泡GC中的LH激活，ERK1/2的不适当激活可能会破坏正常的卵泡发育，且ERK1/2磷酸化增加会诱导GC增殖和迁移[14]。此外，有研究证实MAPK/ERK信号通路的异常激活可使GC增殖，导致异常卵泡生成和卵巢雄激素生成过多[15]。而CLDN6在PCOS中的表达，目前未见相关研究，MAPK/ERK信号通路的异常激活对GC增殖的影响是否与CLDN6表达有关还未可知。本研究旨在探讨CLDN6在PCOS中的表达及其对卵巢GC增殖与凋亡的影响，并分析其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级SD雌性大鼠20只，3周龄，体质量(50±5)g，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司桐乡分公司，生产许可证为SCXK(浙)2020-0002。动物饲养在温度(20±2)℃、湿度(50±5)%、12h光照/12h黑暗周期的环境中，自由摄食和摄水。适应性饲养7d后开始实验。实验按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀，并获得郑州大学第二附属医院伦理委员会批准。

1.2 试剂 脱氢表雄酮(dehydroepian drosterone,DHEA)购自上海源叶生物科技有限公司，货号B73856，纯度≥98%；PD98059(ERK1/2信号通路抑制剂)购自MedChemExpress，货号HY-12028，纯度99.94%；DMEM/F12培养基、胰蛋白酶、胎牛血清均购自美国Gibco公司；CCK-8试剂盒(C0038)、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(C1062L)、细胞裂解液(P0013)、BCA试剂盒(P0010S)均购自碧云天生物科技有限公司；小干扰RNA(siRNA)CLDN6(si-CLDN6)和其阴性对照(si-NC)、pcDNA3.1-CLDN6和pcDNA3.1空载体质粒(pcDNA3.1-NC)以及PCR引物序列由上海GenePharma公司设计合成；Lipofectamine 2000(11668019)购自美国Thermo Fisher Scientific；TRIzol试剂(9108-1)、PrimeScriptTMRT试剂盒(RR037A)、SYBR®Premix Ex TaqTMII试剂盒(RR820A)均购自日本Takara公司；小鼠抗大鼠CLDN6抗体(sc-393671)、山羊抗小鼠IgG二抗(sc-525409)购自Santa Cruz Biotechnology；卵泡刺激素受体(Follicle stimulating hormone receptor,FSHR)抗体(ab75200)、ERK1/2(ab17942)、p-ERK1/2(ab278538)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)(ab16663)、Bcl-2(ab196495)、Bax(ab32503)、Cleaved Caspases-3(ab184787)、GAPDH(ab9485)及二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)均购自英国Abcam公司。

1.3 仪器 细胞培养箱、NanoDrop 2000分光光度计购自美国Thermo Fisher Scientific公司；IX73倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司；ABI Prism® 7300型荧光定量PCR系统购自美国应用生物系统公司；iMark680多功能酶标仪、蛋白转膜装置、FACSCanto II流式细胞仪购自美国Bio-Rad公司。

1.4 方法

1.4.1 模型的建立 所有大鼠适应性喂养1周后，随机选取10只大鼠作为正常对照组，其余大鼠连续21天皮下注射DHEA(6mg/100g，溶于0.2mL豆油)构建PCOS模型(PCOS模型组)，正常对照组大鼠皮下注射0.2mL豆油。从第16天开始连续4天观察阴道涂片，连续出现角质细胞为造模成功[16]。注射DHEA第21d，禁食12h后称重，在超净工作台上无菌环境下摘取大鼠卵巢组织，备用。

1.4.2 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、Western blot检测卵巢组织中CLDN6表达 使用Trizol试剂从组织中提取总RNA，NanoDrop 2000分光光度计测定浓度，使用PrimeScriptTMRT试剂盒逆转录成cDNA。使用SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒进行RT-qPCR。反应体系(25μL)：cDNA(200ng/μL)0.5μL，SYBR®Premix Ex TaqTM(2×)12.5μL，上下游引物(表1)各1μL，ddH2O 10μL。扩增条件：94℃变性2min，94℃ 30s、50～60℃ 30s、72℃ 30s共40个循环。用GAPDH作为内参对照，应用2-ΔΔCt计算CLDN6 mRNA相对表达水平。取部分卵巢组织在RIPA裂解液中裂解，Western blot法检测卵巢组织中CLDN6蛋白表达。

表1 RT-qPCR引物序列

1.4.3 卵巢GC的分离培养与鉴定 用生理盐水冲洗大鼠卵巢组织，解剖显微镜下去除输卵管和脂肪，置于DMEM/F12培养基(含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mmol/L L-谷氨酰胺)，用25号针头穿刺窦卵泡释放GC，使其悬浮在培养基中，用100μm细胞过滤器过滤纯化，将GC重悬，40μm细胞过滤器过滤。200×g离心5min,将分离的GC洗涤两次，在37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。待细胞完全贴壁后，除去未贴壁细胞，每2d更换1次培养基。显微镜观察细胞形态。GC的鉴定：采用免疫细胞化法用FSHR(卵巢GC的特定标记物)表达染色鉴定GC是一种简便快速的方法。制作细胞爬片，24h后将爬片取出，PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定，PBS洗涤，3%过氧化氢孵育15min，正常山羊血清封闭20min，滴加兔抗大鼠FSHR一抗(1∶200)，4℃孵育过夜，PBS清洗，加山羊抗兔二抗(1∶2000)室温孵育30min，DAB显色，苏木素复染，二甲苯透明，封片，显微镜下观察。

1.4.4 分组与转染 取对数生长期GC，按2×105细胞/孔接种于6孔板，将正常对照组大鼠的卵巢GC设为空白组，PCOS模型大鼠卵巢GC分为对照组(正常培养，不进行转染)、si-NC组(转染50nmol/L无干扰作用的si-CLDN6阴性对照siRNA)、si-CLDN6组(转染50nmol/L靶向抑制CLDN6的特异性si-CLDN6)、pcDNA3.1-NC组(转染50nmol/L pcDNA3.1-CLDN6阴性对照空载体质粒)、pcDNA3.1-CLDN6组(转染50nmol/L pcDNA3.1-CLDN6载体质粒)、PD98059组(给予20μmol/L的PD98059处理)、pcDNA3.1-CLDN6+PD98059组(在转染前6h给予20μmol/L的PD98059处理GC，然后再转染50nmol/L pcDNA3.1-CLDN6载体质粒)，待细胞生长至80%融合时，参照Lipofectamine 2000说明书步骤操作进行转染。37℃、5% CO2培养箱继续培养48h。RT-qPCR检测细胞中CLDN6 mRNA表达验证转染效果；转染成功后，用于后续实验。RT-qPCR步骤同1.4.2。

1.4.5 CCK-8法检测细胞活力 将GC按1×104细胞/孔接种到96孔板，待细胞生长至80%融合时，按1.4.4步骤进行分组和处理，培养48h，加10μL/孔CCK-8试剂，继续培养2h。使用酶标仪检测450nm波长下各孔吸光度值(optical density，OD)。

1.4.6 流式细胞术检测细胞凋亡 将GC以1×105细胞/孔接种在6孔板，待细胞生长至80%融合时，按1.4.4的步骤进行分组和处理，48h后，胰蛋白酶消化细胞，制备细胞悬液，冷PBS洗涤2～3次，重悬细胞，使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒在室温下用FITC-Annexin V和PI各5μL染色15min。使用流式细胞术分析凋亡细胞。

1.4.7 Western blot法检测细胞CLDN6、MAPK/ERK通路和增殖、凋亡相关蛋白表达 将GC置于含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的细胞裂解液中进行裂解。使用BCA试剂盒测定蛋白质浓度。SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质并转移至PVDF膜。将膜用5%脱脂牛奶封闭1h，将膜与一抗(CLDN6、ERK1/2、p-ERK1/2、Cyclin D1、cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2按1∶500稀释，GAPDH按1∶1000稀释)4℃孵育过夜。将膜进一步与辣根过氧化物酶偶联的二抗(1∶4000)室温孵育1h，ECL显色。使用Image-Pro Plus 6.0软件定量条带强度。GAPDH为内参，分析结果。

2 结 果

2.1 CLDN6在大鼠卵巢组织中的表达 RT-qPCR和Western blot检测结果显示，与正常对照组相比，PCOS模型组大鼠卵巢组织中CLDN6 mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，见图1、表2。

图1 大鼠卵巢组织CLDN6蛋白表达

表2 大鼠卵巢组织CLDN6 mRNA和蛋白表达

2.2 卵巢GC的鉴定 随着培养时间的增加，GC逐渐出现纺锤体形态(图2A、B)；免疫细胞化法检测结果显示，与正常对照组相比，PCOS模型组大鼠的卵巢GC中FSHR阳性表达显著增强(P<0.05)(图2C、D)。

图2 大鼠卵巢GC的培养与鉴定A、B:分别为培养1d、3d的GC形态(100×);C、D:分别为正常对照组、PCOS模型组GC FSH的表达(400×)

2.3 各组卵巢GC中CLDN6表达 与空白组相比，对照组GC中CLDN6 mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与对照组相比，si-CLDN6组GC中CLDN6 mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，pcDNA3.1-CLDN6组GC中CLDN6 mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与PD98059组相比，pcDNA3.1-CLDN6+PD98059组GC中CLDN6 mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见图3、表3。

图3 各组卵巢GC中CLDN6蛋白表达A:空白组;B:对照组;C:si-NC组;D:si-CLDN6组;E:pcDNA3.1-NC组;F:pcDNA3.1-CLDN6组;G:PD98059组;H:pcDNA3.1-CLDN6+PD98059组

2.4 干扰CLDN6表达对卵巢GC活性和凋亡的影响 与空白组相比，对照组GC活性显著升高，凋亡率显著降低(P<0.05)；与对照组相比，si-CLDN6组和PD98059组GC活性显著降低，凋亡率显著升高(P<0.05)，pcDNA3.1-CLDN6组GC活性显著升高，凋亡率显著降低(P<0.05)；与pcDNA3.1-CLDN6组相比，pcDNA3.1-CLDN6+PD98059组GC活性显著降低，凋亡率显著升高(P<0.05)；与PD98059组相比，pcDNA3.1-CLDN6+PD98059组GC活性显著升高，凋亡率显著降低(P<0.05)，见表4。

表3 各组卵巢GC中CLDN6的表达

表4 干扰CLDN6的表达对卵巢GC活性和凋亡的影响

2.5 干扰CLDN6表达对卵巢GC增殖和凋亡相关蛋白表达的影响 与空白组相比，对照组GC中Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达显著升高，Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达显著降低(P<0.05)；与对照组相比，si-CLDN6组和PD98059组GC中Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达显著降低，Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达显著升高(P<0.05)，pcDNA3.1-CLDN6组GC中Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达显著升高，Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达显著降低(P<0.05)；与pcDNA3.1-CLDN6组相比，pcDNA3.1-CLDN6+PD98059组GC中Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达显著降低，Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达显著升高(P<0.05)；与PD98059组相比，pcDNA3.1-CLDN6+PD98059组GC中Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达显著升高，Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达显著降低(P<0.05)；见图4、表5。

图4 干扰CLDN6的表达对卵巢GC增殖和凋亡相关蛋白表达的影响A:空白组;B:对照组;C:si-NC组;D:si-CLDN6组;E:pcDNA3.1-NC组;F:pcDNA3.1-CLDN6组;G:PD98059组;H:pcDNA3.1-CLDN6+PD98059组

表5 干扰CLDN6的表达对卵巢GC增殖和凋亡相关蛋白表达的影响

2.6 干扰CLDN6表达对卵巢GC中ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达的影响 与空白组相比，对照组GC中p-ERK1/2蛋白表达显著升高(P<0.05)；与对照组相比，si-CLDN6组和PD98059组GC中p-ERK1/2蛋白表达显著降低(P<0.05)，pcDNA3.1-CLDN6组GC中p-ERK1/2蛋白表达显著升高(P<0.05)；与pcDNA3.1-CLDN6组相比，pcDNA3.1-CLDN6+PD98059组GC中p-ERK1/2蛋白表达显著降低(P<0.05)；与PD98059组相比，pcDNA3.1-CLDN6+PD98059组GC中p-ERK1/2蛋白显著升高(P<0.05)。见图5、表6。

图5 干扰CLDN6的表达对卵巢GC中ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达的影响A:空白组;B:对照组;C:si-NC组;D:si-CLDN6组;E:pcDNA3.1-NC组;F:pcDNA3.1-CLDN6组;G:PD98059组;H:pcDNA3.1-CLDN6+PD98059组

表6 干扰CLDN6表达对卵巢GC中ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达的影响

3 讨 论

GC为卵泡发育和卵母细胞成熟提供了合适的微环境。为了响应垂体促性腺激素分泌，GC上调多种基因的表达，这些基因编码参与雄激素生物合成的类固醇生成途径和代谢途径的成分[17]。最近研究表明，在患有PCOS的女性中，GC异常增殖，并与卵巢内雄激素的过量产生有关[5-8]。另有研究显示，PCOS患者的GC凋亡率降低，且与凋亡效应子Caspase-3水平的降低和抗凋亡蛋白水平的增加及较高的增殖率相关[18]。这提示GC的异常增殖和凋亡可能是卵泡发育异常的基础。因此，探索PCOS女性GC异常增殖的机制具有重要意义。

MAPK/ERK通路由一系列细胞蛋白组成，这些蛋白促进信号从细胞质到细胞核的转导，通过磷酸化级联反应调节细胞存活、增殖和分化[19-20]。其中ERK1/2的磷酸化可激活细胞周期进程，调解激素和生长因子的促有丝分裂作用，刺激卵巢GC的细胞增殖、分化和分泌的活性[21-22]，并抑制细胞凋亡[23]。据报道，在PCOS患者中，降低p-ERK1/2蛋白表达量，抑制MAPK/ERK通路异常活化，可改善PCOS胰岛素抵抗[24]，并且可抑制从PCOS患者分离的卵巢GC增殖[25]。动物研究也显示，抑制ERK1/2磷酸化可增加小鼠卵巢GC凋亡[26]。本研究结果显示，从PCOS模型大鼠卵巢中分离的GC中p-ERK1/2水平及GC活性均高于正常大鼠卵巢GC，而GC凋亡率低于正常大鼠卵巢GC，且使用PD98059抑制ERK1/2信号通路可降低GC活性，诱导GC凋亡。表明MAPK/ERK信号通路是调节GC增殖和凋亡的重要通路。

CLDN6在生殖细胞肿瘤和EC、卵巢癌中高度表达，下调其表达具有抑制癌细胞生长和诱导细胞凋亡的作用[9-12]。CLDN6受多种转录因子的调控，CLDN6主要通过ASK1参与细胞凋亡，而ASK1是MAPK激酶家族的成员，已被证明与CLDN6的水平呈正相关[13]。提示CLDN6主要通过MAPK信号通路发挥作用。本研究中，通过皮下注射DHEA诱导建立了PCOS大鼠模型，RT-qPCR和Western blot检测结果显示，PCOS模型大鼠卵巢组织和GC中CLDN6 mRNA和蛋白表达水平均高于正常大鼠卵巢组织和GC，并且其高表达与PCOS中GC的增殖活性升高趋势一致。鉴于此，推测CLDN6可能通过MAPK/ERK信号通路参与PCOS中GC的增殖和凋亡。

为了进一步验证此推测，利用小分子干扰RNA(siRNA)技术和pcDNA3.1质粒转染下调/上调GC中CLDN6表达。结果显示，GC中CLDN6表达水平上调，可升高GC的增殖活性，降低凋亡率，同时p-ERK1/2水平增加；而下调CLDN6表达显示相反的结果；这提示CLDN6高表达与GC的异常增殖和凋亡有关。而MAPK/ERK信号通路是否参与CLDN6对GC异常增殖和凋亡的调控作用尚不明确。因此，本研究在上调CLDN6表达的基础上，联合应用ERK1/2抑制剂PD98059以抑制ERK1/2活化，结果显示，PD98059可升高Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平，降低Cyclin D1、Bcl-2蛋白水平，减弱CLDN6高表达对GC增殖的促进作用和GC凋亡的抑制作用；提示下调CLDN6可能通过抑制MAPK/ERK信号通路，抑制PCOS大鼠卵巢GC增殖并诱导GC凋亡。

综上所述，CLDN6在PCOS大鼠卵巢组织和GC中呈高表达，并且可能通过MAPK/ERK信号通路参与PCOS大鼠卵巢GC的增殖和凋亡。本研究从体外细胞水平上初步探究了CLDN6对PCOS大鼠卵巢GC增殖和凋亡的影响及可能的分子机制，尚需大样本和体内实验进一步验证。