基于PI3K/Akt通路探究丙泊酚对七氟烷诱导大鼠神经细胞凋亡的保护作用

张伟，朱贤林，吴帮林，朱荣誉，潘琴，梅荣

七氟烷是临床麻醉中应用较广的吸入性麻醉剂，但可损伤中枢神经系统，从而影响患者学习、记忆、神经发育，七氟烷吸入过量，会对海马神经细胞产生严重损伤，导致其大量凋亡[1-2]。大脑海马区属于一种复杂的大脑中枢神经系统，一旦海马神经细胞发生损伤，会导致记忆功能、学习能力下降，出现认知障碍[3]。活化磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K)在细胞中参与程序性细胞死亡过程，蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)属于其下游分子，依靠PI3K调节，对多种转录因子有调控作用，抑制凋亡基因表达[4]。林晨等[5]研究指出，PI3K/Akt通路激活对创伤性脑损伤神经保护作用显著。丙泊酚属于一种静脉麻醉药物，能减轻七氟烷产生的应激反应，对心脑血管有一定的保护作用[6]，但目前其具体的作用机制尚不明确。本研究基于PI3K/Akt通路探究丙泊酚对七氟烷诱导大鼠神经细胞凋亡的保护作用，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)动物：健康、清洁级Wistar雄性大鼠30只，日龄3周，体质量220～260 g，均由华北制药股份有限公司提供，SYXK(冀)2019-011。大鼠均常规饲养，自由饮食饮水，饲养温度20～25℃，湿度50%左右，黑/白光照12 h交替。(2)试药试剂：戊巴比妥钠、4%多聚甲醛及其试剂盒(碧云天生物科技有限公司),乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、bcl-2相关的X基因(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase-3)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽-过氧化氢酶(GSH-Px)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)及其试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)；(3 )仪器设备：圆形水迷宫(北京广精仪仪器设备有限公司，型号XR-XM101)，显微镜(上海无陌光学仪器有限公司，型号XYH-3B)，温箱(上海慧夏仪器设备有限公司，型号 WHTH-150)，酶标仪(无锡集佳智能科技有限公司，型号 VarioskanLUX)，红外荧光成像系统(上海易汇生物科技有限公司，型号 FOTRIC)。

1.2 实验方法 2020年1月—2021年1月于湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院实验室进行实验。30只Wistar雄性大鼠随机数字表法分为对照组、七氟烷组、七氟烷+丙泊酚组(联合组)，各10只。七氟烷组吸入1.5%七氟烷，1 h/d；联合组在七氟烷组基础上加丙泊酚150 mg/kg腹腔注射；对照组给予等体积的生理盐水干预。3组均连续干预2周。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 Morris水迷宫实验：干预结束后，各组大鼠行Morris水迷宫实验，将圆形水迷宫分为4个象限，选择任意一个象限，在其水面下置隐蔽平台，大鼠随机放入水中，大鼠寻找平台时间即为逃避潜伏期(4个象限入水点各训练1次/d，每次间隔20 min)，统计大鼠第5 天逃避潜伏期。第6 天进行空间探索实验，平台撤去，随机选择1个象限放入大鼠，统计大鼠60 s内穿越平台位置次数、目标象限停留时间占比。

1.3.2 海马神经细胞凋亡观察：采用戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠后，开胸取出神经组织，采用生理盐水冲洗后，在4%多聚甲醛中固定；分离海马组织，于4%多聚甲醛固定48 h，石蜡包埋，制作切片(3 μm)，严格按照TUNE试剂盒说明书操作，显微镜下随机选择5个视野，统计阳性细胞数量，棕黄色细胞颗粒为阳性，阳性细胞率即为海马神经细胞凋亡率。

1.3.3 氧化应激指标、凋亡相关因子水平检测：采用酶联免疫吸附法(ELISA)法检测。提取脑组织匀浆包被液适当稀释，加到聚苯乙烯反应板各孔中，加盖 4℃保存 24 h。次日使用洗涤液进行3次全方位洗涤，甩干；各孔内加不同稀释倍数的待检标本0.1 ml，同时增加阳性和阴性对照，置于43℃温箱60 min，移去液体；同前洗涤3次，甩干；各孔内加稀释LDH、MDA、SOD、GSH-Px、Bax、Caspase-3、Bcl-2各 0.1 ml，置43℃温箱60 min。移去液体，同前洗涤3次，甩干；各孔加底物液0.1 ml，置黑暗处20 min；各孔内加2 mol/L的LDH、MDA、SOD、GSH-Px、Bax、Caspase-3、Bcl-2各0.05 ml，终止反应。试剂盒购自北京北方生物技术研究所，实验操作步骤严格根据说明书进行。

1.3.4 PI3K/Akt通路蛋白检测：采用免疫印迹(Western blot，WB)将PI3K、p-Akt(大鼠神经组织)标本提取液，离心处理后提取沉淀，滴加裂解液、反复冻融后，再离心处理，提取上清液，采用酶标仪检测PI3K、p-Akt蛋白浓度，保存。PI3K、p-Akt样本滴加10%的分离胶，封闭，吸干水分，给予5%的浓缩胶灌注，凝固后，将其在电泳槽中固定，加 Marker、变性蛋白样品5 μl，电泳干预30 min，待蛋白分离胶底，结束电泳；转膜成功后将硝酸纤维素膜(NC)在5%脱脂奶粉中封闭固定1 h，加一抗(PI3K、p-Akt 1∶1 000)孵育，经过震荡洗膜后加二抗(PI3K、p-Akt 1∶10 000)，孵育，再次震荡洗膜，使用红外荧光成像系统对结果给予分析。以GAPDH为内参。

2 结 果

2.1 各组大鼠Morris水迷宫实验比较 逃避潜伏期比较，七氟烷组>联合组>对照组(P<0.01)；穿越平台次数、目标象限停留时间占比比较，七氟烷组<联合组<对照组(P<0.01)，见表1。

表1 3组大鼠Morris水迷宫实验比较

2.2 各组大鼠海马神经细胞凋亡率比较 海马神经细胞凋亡率比较，七氟烷组(39.50%±4.15%)>联合组(20.55%±3.50%)>对照组(5.10%±1.55%)(F=36.834，P=0.001)；联合组大鼠海马神经细胞凋亡率低于七氟烷组(t=11.040，P=0.001)，见图1。

图1 各组大鼠海马神经细胞凋亡情况比较(TUNEL染色，×200)

2.3 各组大鼠脑组织氧化应激指标比较 LDH、MDA水平比较，七氟烷组>联合组>对照组(P<0.01)，SOD、GSH-Px水平比较，七氟烷组<联合组<对照组(P<0.01)，见表2。

表2 3组大鼠氧化应激指标水平比较

2.4 各组大鼠脑组织凋亡相关因子水平比较 Bax、Caspase-3水平比较，七氟烷组>联合组>对照组(P<0.01)；Bcl-2水平比较，七氟烷组<联合组<对照组(P<0.01)，见表3。

表3 各组大鼠脑组织凋亡相关因子水平比较

2.5 各组大鼠PI3K/Akt通路蛋白表达比较 PI3K、p-Akt蛋白表达比较，七氟烷组<联合组<对照组(P<0.05)，见表4、图2。

图2 各组大鼠PI3K/Akt通路蛋白表达比较

表4 各组大鼠PI3K/Akt通路蛋白表达比较

3 讨 论

相关研究显示，吸入麻醉会导致神经毒性产生，可能与老年认知功能的衰退相关，但作用机制仍不确定[7]。吸入七氟烷会引起记忆损伤，主要是因为吸入七氟烷会影响海马区CA1区椎体神经元电压门控通道，在大脑发育过程中，抑制神经元电压门控通道，引起神经细胞凋亡[8-9]。目前七氟烷产生的认知障碍是麻醉医学研究的重中之重。丙泊酚作用特点是起效快、消除迅速，能提高中枢抑制性神经传递，从而抑制中枢兴奋性，这一功能特殊，与其他类型麻醉镇静药物比较，其在临床应用中潜能更大[10]。

本结果显示，丙泊酚能增加大鼠逃避潜伏期，减少穿越平台次数，缩短目标象限停留时间，从而改善大鼠记忆、认知能力。肖秀英等[11]研究也指出，丙泊酚+七氟烷能降低大鼠逃离时间，减少错误反应次数和Longa评分，从而有效改善大鼠神经功能和记忆能力，与本研究结果保持一致。海马神经细胞凋亡是导致大鼠神经功能损伤的主要原因[12]。本研究中丙泊酚能降低海马神经细胞凋亡率，从而抑制海马神经细胞凋亡，进一步改善大鼠神经功能。

SOD作为一种抗氧化酶，具有清除自由基的作用，可以协同GSH-Px将自由基产生的过氧化物分解酶清除，避免氧化应激损伤[13]。MDA属于脂质氧化产物，具有一定的细胞毒性，LDH是一种糖原溶解酶，反映细胞膜损伤程度[14]。研究显示，氧化应激反应增加会导致神经元受损，SOD、GSH-Px作为内源性抗氧化酶在抗氧化防御机制中起着重要作用[15-16]。本研究中丙泊酚通过使LDH、MDA水平下降，SOD、GSH-Px水平升高，改善七氟烷诱导大鼠产生的氧化应激反应，通过调节氧化应激起到神经保护作用。Bax是线粒体膜主要的成分之一，Bcl-2在线粒体膜外广泛分布，对线粒体膜通透性有一定的调节能力，在细胞凋亡中至关重要[17]。Caspase-3主要是通过Caspase-9自身裂解产生，参与细胞凋亡级联反应，引发细胞凋亡[18]。本研究中丙泊酚通过下调Bax、Caspase-3水平，上调Bcl-2水平从而抑制海马区细胞凋亡，改善大鼠神经功能。

PI3K/Akt信号通路在细胞中具有双重作用，一方面能抑制Bcl-2相关死亡促进因子，对细胞增殖有诱导作用，另一方面将下游抗凋亡蛋白激活，起到抗凋亡作用[19-20]。已有研究证实，大鼠在七氟烷吸入前给予一定的LY294002和依达拉奉干预，LY294002会逆转依达拉奉对海马区神经元保护作用，将PI3K/Akt信号通路激活抑制海马区神经元凋亡[21]。本结果显示，丙泊酚通过上调PI3K、p-Akt表达，将PI3K/Akt信号通路激活，下游Bax、Caspase-3蛋白下调，Bcl-2蛋白上调抑制海马区神经细胞凋亡。

综上所述，丙泊酚能改善七氟烷诱导大鼠认知功能损伤，通过调节LDH、MDA、SOD、GSH-Px水平改善大鼠氧化应激反应，激活PI3K/Akt通路，调控下游Bax、Caspase-3、Bcl-2水平抑制神经细胞凋亡，为临床研究丙泊酚作用机制提供数据支持。本研究的局限性未对丙泊酚使用剂量进行分组研究，因此，需要后续研究丙泊酚使用的最佳剂量。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

张伟、朱贤林：设计课题、研究方案，实施研究过程，论文撰写；吴帮林、朱荣誉：提出研究思路，分析实验数据，论文审核; 潘琴：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改;梅荣：进行统计学分析