miR-522促进食管癌增殖和转移的作用机制研究

许明召，景凯，崔贵，李易桐，邢涪涵

食管癌是全球与癌症相关死亡的第六大原因，全世界每年报告近33万新发病例，每年死于食管癌的人数超过27万例[1]。尽管食管癌诊断技术和治疗手段在不断的进步，但是由于食管癌患者早期无明显症状，通常在晚期时被确诊，其预后仍然较差[2]。由于致癌物暴露和营养缺乏，中国是食管癌的高危地区，情况更为严重，因此迫切需要探索食管癌新的治疗手段以改善患者的预后[3]。微小RNA(microRNA, miRNA)是小的内源性非编码RNA，在肿瘤的发生发展过程中起着至关重要的作用[4]。miR-522是与肿瘤恶性进展密切相关的miRNA之一，研究报道其在不同的肿瘤中发挥不同的生物学功能。研究显示，miR-522在卵巢癌和子宫内膜癌等肿瘤中发挥抑癌作用[5-6]；而在骨肉瘤、肝细胞肝癌和胃癌等肿瘤中发挥促癌作用，密切调控肿瘤细胞的增殖、转移和耐药等恶性生物学行为[7-9]，可作为抗肿瘤治疗的潜在靶点。但miR-522在食管癌中尚未有研究报道，因此，现观察miR-522在食管癌中的表达水平及作用，旨在获得miR-522作为抗食管癌潜在分子靶点的实验室依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2014年1月—2015年6月辽宁省健康产业集团阜新矿总医院心胸外科行食管癌根治性手术60例，患者术前未接受过任何形式的治疗，病理证实为食管癌组织。其中男33例，女27例；年龄：≤60岁26例，>60岁34例；肿瘤大小：<3 cm 40例，≥3 cm 20例；淋巴结转移：无 21例，有 39例；TNM分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期14例，Ⅲ期15例，Ⅳ期13例。本研究经医院伦理委员会审核，患者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 观测指标与方法

1.2.1 不同组织miR-522表达检测：将手术中留取的食管癌和癌旁组织(距离肿瘤5 cm的非癌食管组织) 加入Trizol裂解液(北京百奥莱博科技有限公司)，移至EP管中加入氯仿，低温高速离心20 min，吸取上层液体加入异丙醇试剂混匀，低温高速离心20 min，加入无水乙醇洗涤2次后加入DEPC液，获得组织总RNA。采用OneStep RT-PCR试剂盒(德国Qiagen公司)进行RNA逆转录和qRT-PCR扩增反应，其体系为QIAGEN One Step RT-PCR Buffer 4 μl、dNTP Mix 1 μl 、QIAGEN One Step RT-PCR Enzyme Mix 0.8 μl、上下游引物各0.4 μl、RNA 1 μg和DEPC液补足20 μl。反应条件为逆转录50℃ 30 min、95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环，72℃终延伸10 min。miR-522上游引物：5’-TTTGGATCCAGCTAACCTGCTGATTCTTTG-3’，下游引物：5’-TAAGAATTCAGGTCGCAGTGAGCAGAGT-3’；GAPDH上游引物：5’-CTGGGCTACACTGAGCACC-3’，下游引物：5’-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’。按照2-ΔΔCt公式以GAPDH为内参计算miR-522的相对表达量。miR-522和内参GAPDH引物由上海生工试剂公司合成。

1.2.2 食管癌细胞系培养和转染：食管癌细胞系GES-1、MKN1和Eca109及人正常食管黏膜上皮细胞系HEEC(中国科学院细胞库)均采用含有10%胎牛血清的细胞培养基(美国Gibco公司)培养，放置在5%CO2、37℃的细胞培养箱中培养。细胞长满时采用胰酶(美国Gibco公司)消化进行细胞传代。收集细胞斑块，加入Trizol裂解液提取细胞总RNA。采用qRT-PCR检测各个细胞系中miR-522的表达水平。miR-522表达最高的Eca109细胞以每孔2×105个接种至6孔板中，随机分为NC组和miR-522抑制剂组，细胞贴壁后采用脂质体2000进行细胞转染。NC组转染10 pmol/L NC 抑制剂，miR-522 抑制剂组转染10 pmol/L miR-522 抑制剂(广州瑞博生物试剂有限公司)，培养48 h后采用qRT-PCR检测NC组和miR-522 抑制剂组Eca109细胞中miR-522的表达。

1.2.3 食管癌细胞增殖检测:NC组和miR-522 抑制剂组分别以每孔1 500个Eca109细胞重悬至150 μl培养基中，每组设置6个重复孔接种至96孔板中。分别在贴壁后的0 h、24 h、48 h和72 h时，更换新鲜培养基并加入 MTS试剂20 μl(美国Sigma公司)，放置培养箱中继续培养2 h，采用酶标仪检测NC组和miR-522 抑制剂组Eca109细胞在490 nm处的吸光度(OD值)。

1.2.4 食管癌细胞周期检测：胰酶消化收集NC组和miR-522 抑制剂组食管癌Eca109细胞，PBS缓冲液洗涤3次后按照细胞周期检测试剂盒(上海碧云天生物试剂有限公司)说明书进行染色，以每管6×105个Eca109细胞中加入500 μl染色缓冲液、 PI染色试剂25 μl和RNA酶10 μl混匀，37℃避光孵育30 min，于流式细胞仪上机检测，Flow Jo软件进行数据分析。

1.2.5 食管癌细胞转移检测：NC组和miR-522 抑制剂组食管癌Eca109细胞胰酶消化后，无血清培养基洗涤3次，以每孔1×105个Eca109细胞重悬至无血清培养基100 μl中，接种至Transwell小室(美国Coring公司)上室膜上，下室加入含有10%胎牛血清的培养基500 μl作为趋化因子，每组设置3个重复孔。放置培养箱中培养10 h后终止细胞培养。将Transwell小室膜上室面未穿过的细胞擦去后，PBS缓冲液洗涤3次后甲醇固定10 min，吉姆萨染色10 min后在显微镜下计数细胞穿膜数目。

1.2.6 食管癌细胞蛋白检测：胰酶消化收集NC组和miR-522 抑制剂组食管癌Eca109细胞，加入蛋白裂解液(上海贝博生物科技公司)，超声裂解细胞30 min，离心后将上清移至新EP管中，获得细胞总蛋白。并采用BCA试剂盒(美国Thermo公司)检测蛋白浓度，加热煮沸蛋白变性后上样进行凝胶电泳，80 V电泳2 h，并350 mA将蛋白转移至PVDF膜(美国Promega公司)上。5%封闭液室温孵育1 h，TBST洗涤3次后，与一抗稀释液4℃孵育过夜(CyclinD1、CDK4、CDK6、E-cadherin、N-cadherin、Snail稀释液均为1∶500，抗体均购自美国cell signaling公司)，与二抗稀释液室温孵育2 h，蛋白条带采用ECL化学发光试剂盒(上海慧颖生物科技有限公司)进行曝光。

2 结 果

2.1 不同组织miR-522表达 食管癌组织 miR-522相对表达量为(2.11±0.81)，高于癌旁组织的表达(1.44±0.75)，差异有统计学意义(t=4.912，P=0.000)。

2.2 食管癌细胞系及HEEC细胞中miR-522表达比较 miR-522在食管癌细胞系TE-1、TE-8、Eca109和人正常食管上皮细胞系HEEC中的表达水平分别(3.39±0.60)、(4.78±0.89)、(6.66±0.67)和(1.14±0.06)， miR-522在食管癌细胞中的表达显著高于人正常食管上皮细胞HEEC，其中在Eca109细胞中的表达最高(F=40.427，P=0.000)，因此选择Eca109细胞进行后续miR-522的功能研究。

2.3 miR-522 抑制剂转染效果 NC组miR-522的表达量为(1.00±0.04)，高于miR-522抑制剂组的 (0.32±0.06)，差异有统计学意义 (t=16.334,P=0.000)。

2.4 miR-522抑制剂对Eca109细胞增殖能力的影响 MTS实验结果显示，NC组0 h、24 h、48 h、72 h OD值分别为0.29±0.01、0.62±0.10、1.01±0.13、1.35±0.07，miR-522抑制剂组分别为0.29±0.01、0.40±0.05、0.55±0.12、0.75±0.15。2组24 h、48 h、72 h比较差异有统计学意义(t=3.557、4.623、6.412,P=0.024、0.010、0.003)。

2.5 miR-522 抑制剂对Eca109细胞转移能力的影响 Transwell实验结果显示，NC组细胞的穿膜细胞数为(68.67±8.23)个，高于miR-522 抑制剂组的(24.33±6.27)个，差异有统计学意义 (t=7.421,P=0.001)，见图1。

图1 Transwell实验检测miR-522对Eca109细胞转移能力的影响

2.6 miR-522抑制剂对Eca109细胞周期的影响 流式细胞仪实验结果显示,NC组Eca109细胞G1、S、G2期分别为(58.80±3.94)%、(23.37±2.98)%、(16.50±4.75)%，miR-522抑制剂组分别为(69.10±4.75)%、(18.00±0.01)%、(12.91±3.73)%。与NC组比较，miR-522抑制剂组Eca109细胞仅G1期细胞显著增加(t=2.885、2.598、1.281，P=0.045、0.060、0.269)。

2.7 miR-522抑制剂对Eca109细胞周期和EMT相关蛋白表达的影响 Western-blot结果显示,与NC组比较，miR-522抑制剂组细胞中细胞周期相关蛋白CyclinD1、CDK4、CDK6表达降低(t/P=8.521/0.000,5.792/0.002,7.746/0.001)，EMT相关蛋白N-cadherin、Snail表达降低(t/P=7.359/ 0.001,8.133/0.000)，E-cadherin蛋白表达增加(t/P=6.264/0.002),见图2。

图2 miR-522抑制剂对Eca109细胞周期和EMT相关蛋白的影响

2.8 食管癌组织miR-522表达与患者临床病理参数的关系 miR-522的表达在食管癌患者性别、年龄和肿瘤大小间比较差异均无统计学意义(P>0.05)，有淋巴结转移和TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期表达均升高(P<0.05)，见表1。

表1 miR-522表达在不同食管癌患者临床/病理参数中比较Tab.1 Comparison of miR-522 expression in esophagealcancer patients with different clinical/pathological parameters

2.9 miR-522的表达水平对食管癌患者预后的影响 以miR-522表达水平2.11为界值，将60例食管癌患者分为miR-522高表达亚组(32例)和miR-522低表达亚组(28例)。随访5年，Kaplan-Meier绘制患者生存曲线，Log Rank结果显示，miR-522高表达亚组患者预后较miR-522低表达亚组预后差(χ2=4.468，P=0.035)，见图3。

图3 miR-522不同表达水平食管癌患者预后比较

3 讨 论

食管癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，具有很高的致死率，其发病率和病死率在全球范围内存在差异，在经济欠发达的地区较为普遍[1]。食管癌的治疗手段主要包括手术切除、化疗、放疗和分子靶向治疗，现有的治疗手段未能改善患者的预后，目前接受治疗的食管癌患者5年生存率仅为25%～30%[2]。食管癌的主要危险因素是饮酒、吸烟和引起食管黏膜慢性刺激的疾病[3]，但是其发病机制尚未完全明确，因此研究食管癌发生发展中发挥关键作用的分子，是寻找用于治疗食管癌分子靶标的重要途径。

miRNA是一类长度为20～25个核苷酸的非编码RNA，虽然不具备编码蛋白质的功能，但可通过抑制其靶基因的翻译或通过与3’非翻译区结合而使其靶mRNA降解来调节基因表达。超过50% miRNA的靶基因位于与肿瘤相关的基因组区域，表明miRNA与肿瘤的发病机制密切相关[4]。在食管癌中异常表达并发挥重要作用的miRNA被越来越多报道。miR-522在多种人体组织中表达，并在子宫内膜癌、骨肉瘤、肝细胞肝癌等多种类型的肿瘤中表达失控，并与肿瘤的发生发展密切相关[6-8]。苗志龙等[8]报道miR-522在肝细胞肝癌组织中表达显著升高，且与淋巴结转移、肿瘤分级较差及患者预后较差显著相关，miR-522过表达可作为肝细胞肝癌患者预后不良的生物标志物。miR-522在食管癌中的表达及意义未知，而本研究发现，食管癌组织中高表达的miR-522与患者的淋巴结转移、TNM分期和不良预后相关，与miR-522在肝细胞肝癌中表达的临床意义相似，同时也表明miR-522高表达促进食管癌的恶性进展，可能是食管癌患者预后不良的生物分子标志物。同时本研究检测了miR-522在食管癌细胞系中的表达水平，结果显示，miR-522在4株食管癌细胞系中的表达显著高于人正常食管上皮细胞系HEEC中的表达，与在组织水平的表达相一致，可以进行miR-522在食管癌细胞中的功能研究。

在胃癌细胞中外泌体分泌来源的miR-522通过抑制铁死亡促进胃癌细胞化疗耐药，在骨肉瘤和肝细胞肝癌中miR-522促进肿瘤细胞增殖和转移[7,9-10]，提示miR-522与肿瘤的增殖和转移等肿瘤恶性生物学行为相关。而本研究显示，抑制miR-522的表达后，食管癌细胞的增殖和转移能力降低，与miR-522在其他癌种的研究一致，均发挥促癌作用，但是作用机制需进一步探讨。研究显示，细胞周期与细胞增殖密切相关，其调控紊乱不受控制后是导致细胞恶性增殖的主要机制之一[11]。在肝细胞肝癌中miR-522过表达促进细胞增殖、集落形成和细胞周期G1期至S期的进程，并促进细胞周期蛋白D1(CyclinD1)的表达[10]。本研究发现，抑制miR-522的表达后，食管癌细胞周期阻滞在G1期，表明miR-522在食管癌中同样通过调控细胞周期促进肿瘤细胞的恶性增殖，与Zhang等[10]的报道一致。而细胞周期进程是机体通过细胞周期蛋白及细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)等一系列蛋白经过严格的调控机制完成的，CDKs是包括20个蛋白激酶的家族，其中CDK4和CDK6通过与CyclinD1特异性结合促进G1期至S期的进程[12]。本研究采用Western-blot检测结果显示，抑制miR-522的表达后食管癌细胞中CyclinD1、CDK4和CDK6蛋白的表达均减少，表明miR-522通过调控G1/S期的细胞周期蛋白加速细胞周期进程进而促进细胞增殖。EMT是促进恶性肿瘤转移的重要机制，上皮标志物E-cadherin蛋白表达减少及间皮标志物N-cadherin蛋白表达增加促进EMT，Snail1通过抑制E-cadherin的转录而诱导EMT[13-15]。本研究发现，抑制miR-522表达后食管癌细胞中E-cadherin蛋白表达增加，N-cadherin和Snail1蛋白表达减少。表明miR-522通过调控EMT促进食管癌细胞转移，与Xu等[7]在骨肉瘤中的报道一致。

综上所述，miR-522在食管癌中表达上调，与食管癌恶性进展相关，干扰miR-522的表达后通过调控细胞周期抑制细胞增殖及通过抑制EMT降低细胞转移能力。miR-522可能是食管癌预后不良的分子标志物和抗肿瘤治疗的潜在分子靶标。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

许明召、崔贵：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；景凯：进行统计学分析;李易桐：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改;邢涪涵：课题设计，论文撰写