丙泊酚减低EZH2对miR-34a抑制效应与肠癌细胞增殖侵袭能力变化的研究

梁伟华,蒋 淼

(复旦大学附属华山医院北院宝山分院 上海市宝山区仁和医院麻醉科，上海200431)

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)为世界常见的恶性疾病，且发病率呈逐年上升趋势[1]。手术治疗仍为结直肠癌治疗的主要方式；近年研究发现，麻醉剂可引起细胞代谢、炎症或免疫状态，并在围手术期甚至长远影响患者预后和复发，然而其机制不明[2-3]。丙泊酚(Propofol)为广泛用于手术的麻醉剂。Wu等[4]发现丙泊酚用于结直肠癌治疗与患者良好生存有关。机制研究方面，丙泊酚可增强T细胞杀伤能力，抑制肿瘤免疫逃避作用[5-6]；有研究发现丙泊酚可抑制结直肠癌细胞增殖、上皮间充质转化和细胞转移侵袭能力，发挥抗肿瘤活性[7-8]，但其具体调控靶点尚不明朗。

微小RNA(microRNA，miRNAs)为一类可调控细胞增殖、凋亡、氧化应激、炎症等广泛生物学反应的小分子非编码RNA[9-10]。据报道微小RNA异常表达与肿瘤发生、发展密切相关[11-12]。miR-34为结直肠癌重要抑癌miRNA，可通过干预诸如STAT3、SNAIL、ZEB1等多种促癌因子表达抑制肿瘤细胞增殖、转移、侵袭功能[13-14]。miR-34a在肠癌组织中表达下调[15-17]，其下调与一种表观沉默蛋白卷曲同源2增强子(Enhancer of zeste homolog 2，EZH2)密切相关；研究证实EZH2可招募至miR-34a启动子，引起组蛋白发生甲基化修饰，空间结构发生改变，抑制miR-34a转录[18-20]。因此，抑制EZH2结合、诱导恢复miR-34a表达水平具有重要的临床价值。最新研究发现丙泊酚具有调控细胞miRNA表达水平的作用，如miR-141、miR-200c及miR-9等[21-23]。本文拟对丙泊酚对肠癌细胞增殖、转移和侵袭作用进行研究；探究其对miR-34a是否存在诱导作用，并对诱导机制展开初步研究，为丙泊酚抗肿瘤活性提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人结直肠癌细胞SW480、HCT116购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心。丙泊酚购自美国Sigma Aldrich公司；miR-34a mimics及inhibitor由上海吉玛制药技术有限公司合成；转染试剂LipofectamineTM 3000试剂购自美国Invitrogen公司；EZH2及GAPDH定量采用逆转录-实时荧光定量PCR检测试剂盒购自日本TaKaRa公司；miR-34a及U6定量检测试剂盒购自德国QIAGEN公司；染色质免疫沉淀-定量PCR(SimpleChIP Enzymatic Chromatin IP Kit)购自美国CST公司；CCK-8试剂盒购自碧云天生物有限公司；Transwell小室购自Corning公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：人结直肠癌细胞SW480、HCT116购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心。用含10%胎牛血清、100 μg/ml 链霉素和 100 U/ml青霉素的DMEM高糖培养液，置于27 ℃、5% CO2的培养箱中培养。收集对数生长期的细胞用于后续实验。

1.2.2 细胞处理和实验分组：研究丙泊酚对EZH2和miR-34a作用，分成两组：①对照组，即0.9%氯化钠溶液处理；②丙泊酚组，即丙泊酚处理。研究丙泊酚和miR-34a对肠癌细胞增殖、侵袭作用，分成四组：①对照组，即0.9%氯化钠溶液，同时细胞转染了miRNA阴性对照mimics；②丙泊酚组，即丙泊酚处理；③miR-34a组，即细胞转染miR-34a mimics；④丙泊酚+miR-34a inhibitor组，细胞同时受到丙泊酚及miR-34a inhibitor处理。丙泊酚用培养液稀释与终浓度为10 μg/ml，与肠癌细胞共培养。miR-34a mimics及inhibitor转染细胞采用Lipo3000，按厂商说明书进行转染。

1.2.3 逆转录实时荧光定量(RT-qPCR)：EZH2定量按总RNA提取、逆转录及荧光定量PCR按试剂盒说明书操作。其中各基因引物为：EZH2：F：5’-AAT-CAGAGTACATGCGACTGAGA-3’，R：5’-GCTG-TATCCTTCGCTGTTTCC-3’；GAPDH为内参基因：F:5’-GACCTGACCTGCCGTCTA-3’，R:5’-AG-GAGTGGGTGTCGCTGT-3’。miR-34a定量按miRNA荧光定量PCR按试剂盒说明书操作，其中U6为内参基因。Real-time定量PCR条件为：95 ℃ 10 min后,95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 循环。Real-time定量PCR使用ABI 7500仪器进行。根据待测标本的Ct值，以GAPDH或U6作为内参照，采用2-△△Ct法计算相对表达倍数变化。

1.2.4 染色质免疫沉淀-定量PCR(ChIP-qPCR)：按说明书进行处理，通过细胞甲醛交联、染色体酶促消化、EZH2免疫沉淀、洗脱及解交联、最后纯化DNA，利用qPCR检测 EZH2沉淀DNA中靶基因的含量。

1.2.5 细胞增殖活性检测(CCK-8)：对照组及各处理组细胞以每孔1000细胞接种96孔板，经过各种处理后，于终止时刻加入CCK-8溶液(10 μl/孔)，继续培养4 h。通过酶标仪测量该样品在450 nm处的吸光度值。

1.2.6 细胞侵袭能力：分析肠癌细胞制成单细胞悬液并调整浓度至5×104接种于Transwell小室(铺有Matrigeal胶)，下室加入正常含胎牛血清完全培养基700 μl，培养48 h后取出小室。预冷甲醇，固定10 min，在PBS中用棉签刮去小室上层细胞后，进行结晶紫染色，ddH2O清洗。倒置显微镜取3个视野，计数取均值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件进行分析。两组比较采用独立样本t检验；多组间比较采用Dunnet-t检验；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 丙泊酚对miR-34a及EZH2表达的影响 分别对肠癌细胞株HCT116及SW480进行丙泊酚处理。与对照组比较，丙泊酚组细胞miR-34a表达显著上调(P<0.01)，而EZH2表达水平明显抑制(P<0.01)。见表1。

表1 miR-34a及EZH2在对照组及丙泊酚组中表达比较

2.2 对照组细胞和丙泊酚组细胞EZH2在miR-34a启动子富集程度的比较 利用ChIP-qPCR方法，我们检测了对照组细胞和丙泊酚组细胞中，EZH2于miR-34a启动子富集程度的变化。如表2所示，丙泊酚组SW480及HCT116细胞的EZH2在miR-34a启动子富集程度显著低于对照组细胞(P<0.01)，提示EZH2对miR-34a转录抑制作用减弱。

表2 对照组细胞和丙泊酚组细胞EZH2在miR-34a启动子富集程度的比较

2.3 丙泊酚、miR-34a mimics以及丙泊酚+miR-34a inhibitor联合处理组与对照组肠癌细胞SW480增殖活性比较 鉴于丙泊酚对miR-34a抑制作用，我们分析了两者对肠癌细胞增殖活性的影响。结果发现丙泊酚和miR-34a处理SW480、HCT116细胞48 h，显著抑制其增殖活性(P<0.01)。为分析丙泊酚的抑制作用是否依赖miR-34a，我们又进行了丙泊酚与miR-34a inhibitor联合处理，丙泊酚的抑制增殖活性被miR-34a inhibitor减弱，提示miR-34a是丙泊酚发挥抑制作用的重要干预靶点。见表3、4。

表3 丙泊酚、miR-34a mimics以及丙泊酚+miR-34a inhibitor联合处理组与对照组肠癌细胞SW480增殖活性比较

表4 丙泊酚、miR-34a mimics以及丙泊酚+miR-34a inhibitor联合处理组与对照组肠癌细胞HCT116增殖活性比较

2.4 丙泊酚及miR-34a对肠癌细胞侵袭的影响 Transwell小室试验表明丙泊酚和miR-34a处理SW480、HCT116细胞48 h后，穿膜细胞数显著减少。此外，我们也进行了丙泊酚与miR-34a inhibitor联合处理，丙泊酚的抑制增肠癌细胞侵袭能力被miR-34a inhibitor减弱，提示miR-34a为丙泊酚重要靶点。见图1(表5)。

图1 丙泊酚、miR-34a mimics以及丙泊酚+miR-34a inhibitor联合处理组与对照组肠癌细胞侵袭能力比较(迪夫快速染色，×20)

表5 丙泊酚、miR-34a mimics及丙泊酚+miR-34a inhibitor联合处理组与对照组肠癌细胞侵袭能力比较

3 讨 论

丙泊酚作为静脉麻醉剂有诸多优点，如镇静、催眠、遗忘效应、作用时间短、起效快、易于控制、清醒时间快、不易药物蓄积等[24-25]，因此广泛用于肿瘤切除手术中。最近研究表明丙泊酚除麻醉效应外，还具有抗肿瘤活性，但其药理机制不明确。miR-34a为抑制结直肠癌细胞恶性生物学表型的重要抑癌miRNA；然而在结直肠癌发生、发展过程中由于EZH2导致miR-34a启动子区域染色质空间结构变化，显著抑制了miR-34a转录表达[18,20,26]。因此，解除EZH2-miR-34a作用，可恢复miR-34a生物学功能，为前景较好的干预疗法。

据报道丙泊酚具有调控细胞miRNA表达水平的作用，我们推测丙泊酚是否可能通过EZH2-miR-34a发挥其抗肿瘤活性呢？我们首先对肠癌细胞SW480和HCT116进行了丙泊酚处理，利用qPCR检测发现，丙泊酚可明显诱导miR-34a表达升高，并抑制EZH2表达，证实了丙泊酚对miR-34a和EZH2的调控作用。同时，我们也发现丙泊酚不仅可以减低EZH2的表达，而且也可影响EZH2在miR-34a启动子区的结合程度。利用ChIP-qPCR发现，对照组细胞EZH2相对富集程度可达到38.20～69.36；而丙泊酚处理后，EZH2相对富集程度仅为6.28～11.25，EZH2对miR-34a启动子抑制能力显著减低，进一步阐明了丙泊酚对miR-34a的抑制机理。据文献报道，EZH2结合靶基因启动子后，可催化组蛋白3的第27位赖氨酸发生三甲基化(H3K27me3)修饰甲基化修饰，从而影响靶基因转录活性[27]；同时EZH2作为多梳复合物(Polycomb Group Protein)的催化亚单位，还与其他因子共同介导靶基因的表观沉默[28]。本研究仅揭示了丙泊酚可减少EZH2在miR-34a启动子的富集程度，可能丙泊酚还参与更为复杂的表观调控网络，尚需进一步研究。

我们揭示了miR-34a为丙泊酚靶点后，我们验证了丙泊酚的抗肿瘤作用。有文献报道，丙泊酚可抑制淋巴瘤、宫颈癌、乳腺癌细胞增殖和侵袭作用[20,23]，本研究也同样发现了丙泊酚可在体外抑制肠癌细胞增殖和侵袭。此外，我们也证实了肠癌细胞过表达miR-34a具有抑制细胞增殖和侵袭作用。为进一步研究丙泊酚是否依赖miR-34a的表达发挥其抗肿瘤活性，我们也进行了补救实验，即在丙泊酚处理同时，特异性抑制miR-34a，结果发现丙泊酚的抑制增殖和侵袭作用减弱，佐证了我们的推测。

综上所示，我们发现丙泊酚对肠癌细胞的增殖和侵袭能力具有显著抑制能力。丙泊酚通过减低EZH2的表达及在miR-34a启动子的富集，促进miR-34a转录表达，从机理上揭示了丙泊酚的抗肿瘤作用，为其成为潜在临床肿瘤治疗提供了实验依据。