急性髓系白血病患者骨髓溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶1的表达分析

陈芹,徐子浚,林江,钱军,钱炜

(江苏大学附属人民医院 1.中心实验室,2.血液科,3.耳鼻咽喉头颈外科,江苏 镇江 212002)

异常的脂质代谢是癌细胞的重要特征,并影响许多癌症相关的行为,包括细胞生长、增殖、分化和运动[1]。磷脂酰胆碱是真核细胞膜的主要磷脂,在细胞结构和生物学功能中起着重要作用。溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶1(lysophosphatidylcholine acyltransferase 1,LPCAT1)是细胞膜生物合成中最重要的酶,负责将溶血磷脂酰胆碱转化为磷脂酰胆碱。研究发现LPCAT1在各种实体瘤如前列腺癌[2-3]、口腔鳞状细胞癌[4]、肝癌[5]、乳腺癌[6-7]和肺腺癌[8]中过表达,且其过表达促进了这些实体瘤的进展、转移和复发。然而,很少有研究报道急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者中LPCAT1的表达态势及其临床意义。因此,本研究检测AML患者骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells,BMNC)中LPCAT1mRNA的表达,并分析其表达与患者临床特征的关系。

1 对象与方法

1.1 病例

本研究经江苏大学附属人民医院伦理委员会批准。60例AML患者均为我院门诊和住院患者,男32例、女28例,中位年龄55岁(10～81岁),其中法-美-英(FAB)分型M2型25例,M3型13例,M4型15例,M5型7例。所有患者均签署书面知情同意书。诊断和分型依据FAB和世界卫生组织(WHO)标准(原始细胞≥20%)结合免疫表型和细胞遗传学分析结果[9-10]。27名健康捐献者作为对照组。

1.2 主要试剂和仪器

总RNA提取试剂Trizol(美国Invitrogen公司)；逆转录试剂(美国MBI Fermentas公司)；PCR扩增试剂购自南京Vazyme公司。PCR引物均由北京华大基因科技有限公司合成。ABI7500 PCR仪(美国ABI公司)；Gene Genius凝胶成像仪(美国Syngene公司)。

1.3 qRT-PCR检测AML患者骨髓LPCAT1基因表达

1.3.1 BMNC分离和RNA制备 所有患者和对照均抽取10 mL骨髓,肝素抗凝,Ficoll液分离BMNC,依据厂家说明书使用Trizol试剂提取总RNA,经核酸定量仪定量后立即逆转录或-80 ℃保存备用。

1.3.2 总RNA逆转录 将总RNA应用六随机引物逆转录合成互补DNA(cDNA),总体系40 μL,含2 μg总RNA、10 mmol/L六随机引物、10 mmol/L dNTPs、80单位RNA酶抑制剂和200单位M-MLV逆转录酶。逆转录运行程序为25 ℃ 10 min,42 ℃ 60 min。cDNA于-20℃保存。

1.3.3LPCAT1mRNA检测 采用Primer 5.0软件设计引物。LPCAT1基因上游引物:5′-CGTGA-CCGACCTATTCCGAG-3′,下游引物:5′-GTCTGAGT-TTTCCGGGCTGA-3′。反应体系20 μL,包括0.8 μmol/L的特异性引物、20 ng cDNA、0.4 μmol/L的ROX染料和10 μmol/L的AceQTMqPCR SYBR Green Master Mix(Vazyme)。PCR运行条件为95 ℃ 5 min预变性,95 ℃ 10 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 32 s和80 ℃ 32 s(收集数据),共35个循环。在PCR循环结束时,进行熔解曲线分析程序,以验证PCR产物的特异性。随机选取PCR扩增产物送北京华大基因科技有限公司测序,测序结果核对正确。以管家基因ABL作为参照基因,计算LPCAT1mRNA的相对表达水平。LPCAT1相对表达水平通过2-ΔΔCT方法确定。扩增产物在20 g/L琼脂糖凝胶上100 V电泳40 min,在凝胶成像仪下观察并拍照。

1.4 细胞遗传学检查

将初诊时采集的骨髓细胞采用直接法和24 h短期培养法制备染色体标本,然后进行R显带处理,其中2例患者染色体制备失败。参照文献[11]进行核型危险分级分类。

1.5 统计学分析

应用SPSS 17.0软件进行统计学分析,LPCAT1mRNA低表达与患者性别、临床分型、染色体异常之间的关系采用Fisher精确概率法或χ2检验,连续变量的差异采用Mann-WhitneyU检验进行比较。应用受试者工作特征(ROC)曲线和ROC曲线下面积(AUC)确定LPCAT1表达在区分AML患者与健康对照中的价值。所有分析均设定P值为双侧分布,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AML患者LPCAT1 mRNA表达状况

选取qRT-PCR结果中具有LPCAT1和ABL最小ΔCT的健康对照的骨髓标本作参照物,并认为其LPCAT1表达水平为1.000。结果显示27例健康对照中LPCAT1mRNA表达水平为0.051～1.000(0.344±0.233)。与对照相比,AML患者LPCAT1mRNA的表达(0.001～0.274)显著降低(Z=-5.881,P<0.001),见图1。以LPCAT1mRNA表达水平等于或低于0.041(对照组平均值-1.3倍标准差)判定为LPCAT1mRNA低表达。结果显示60例AML患者中27例(45%)存在LPCAT1mRNA低表达,而27例对照均未见LPCAT1mRNA低表达,差异有统计学意义(χ2=17.618,P<0.001)。典型的PCR产物电泳结果见图2。

图1 AML患者和对照组LPCAT1 mRNA相对表达水平

2.2 LPCAT1低表达与AML患者临床特征的关系

以0.041为界将AML患者分为LPCAT1低表达组和LPCAT1高表达组,两组临床特征及实验室参数见表1。LPCAT1低表达组与高表达组在年龄、性别、白细胞计数、血红蛋白浓度、血小板计数等方面均无显著差异(P>0.05)。所分析的AML亚型中均可见LPCAT1低表达。FAB亚型中,LPCAT1低表达频率差异无统计学意义(P>0.05)。不同核型危险分级患者LPCAT1低表达频率差异亦无统计学意义(P>0.05)。

1-2:健康对照；3-7:AML；8:阳性对照；9:阴性对照图2 AML患者和对照组LPCAT1基因表达的qRT-PCR电泳结果

表1 AML患者LPCAT1 mRNA表达与临床特征的关系

2.3 LPCAT1 mRNA在AML中的诊断价值

应用ROC曲线评估LPCAT1表达区分AML患者与健康对照的能力,AUC为0.896(95%CI:0.825～0.967,P<0.001),见图3。当LPCAT1mRNA表达的截断值为0.173时,敏感性和特异性分别为88.3%和81.5%,表明LPCAT1表达水平可作为AML的潜在诊断标志物。

图3 ROC曲线分析LPCAT1表达诊断AML

3 讨论

目前为止,很少有研究报道LPCAT1基因在AML患者骨髓中的表达状态。Wang等[12]研究了48例AML患者和20例健康对照外周血样本中LPCAT1的表达,结果发现AML患者外周血标本中LPCAT1表达显著增高。然而,外周血标本并不能很好地反映LPCAT1在AML中的表达状态,因为AML是一种源自骨髓中未成熟髓系祖细胞的恶性疾病,骨髓样本更具有代表性。本研究结果表明,与健康对照的骨髓样本相比,AML患者骨髓样本中LPCAT1mRNA的表达显著降低。

已有研究发现在部分实体瘤中LPCAT1表达上调且其上调与肿瘤进展、转移、复发和预后不良相关,表明LPCAT1可能在实体瘤中起到癌基因的作用。然而,与实体瘤中的高表达相反,本研究结果显示LPCAT1的表达在AML这一非实体肿瘤中明显下调,说明LPCAT1可能在实体瘤和血液系统肿瘤(如AML)中发挥不同的作用。两者之间LPCAT1表达的差异可能归因于不同的组织来源和肿瘤病理。实际上,已有研究证实AML中某些基因如特异AT序列结合蛋白1(SATB1)、RAS相关区域家族1A(RASSF1A)和基质金属蛋白酶1(MMP1),其表达或功能与实体瘤不同[13-15]。

进一步进行ROC曲线分析显示,LPCAT1mRNA表达可用于区分AML与健康对照,AUC为0.896(95%CI:0.825～0.967,P<0.001),截断值为0.173时具有较高的敏感性和特异性,表明LPCAT1mRNA表达可作为诊断AML的潜在生物标志物,或可用于AML的辅助诊断。

综上,本研究结果显示,LPCAT1低表达是AML发生过程中的一个常见分子事件,但LPCAT1在AML发生发展中的作用机制还有待于进一步研究。