小鼠骨髓间质干细胞来源的胞外囊泡对尼古丁诱导的小鼠生精细胞损伤的修复作用

刘子瑶,黄玥,王超,李涛,王晶哲,蔺博涵,王子璇,孙晓春,陈华标

(1.江苏大学医学院,江苏 镇江 212013；2.上海市东方医院马歇尔消化道疾病国际诊疗中心实验室,上海 200120；3.哈佛医学院麻省总医院疫苗和免疫治疗中心,马萨诸塞州 波士顿 02114)

吸烟不仅对肺部损伤严重,对于男性精液的危害更为严重,长期吸烟者精子的各项质量指标都会降低[1]。尼古丁是烟草中主要的活性成分,又名烟碱,吸入并沉积于机体内会使机体生理功能紊乱,导致多组织、器官慢性损伤,引发肺癌、动脉粥样硬化、冠心病等多种疾病发生[2]。

当前我国不孕不育人数约占人口比例15%,其中,约50%由男性不育引起[3],已证实吸烟可致精子氧化损伤、DNA加合物、DNA链断裂、染色体畸变和遗传突变[4]。尼古丁可通过多种途径影响生殖细胞功能,最终致使机体出现生精障碍[5]、不育[6-7]。间质干细胞通过释放胞外囊泡和其他介质发挥旁分泌作用,经证实小鼠骨髓间质干细胞来源的胞外囊泡(mBMMSCs-EVs)和介质携带有细胞保护的相关信号[8]。此外,mBMMSCs-EVs包含的DNA、mRNA和蛋白质在细胞信号转导中起重要作用[9]。mBMMSCs-EVs在小鼠DBA/1模型中具有抗炎作用[10]；同时,其对组织损伤具有修复作用[11],但mBMMSCs-EVs对尼古丁诱导的生精细胞损伤的影响尚不清楚。因此,本研究拟以生精细胞GC-1为研究对象,探讨mBMMSCs-EVs对尼古丁诱导的生精细胞损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞系、主要试剂及仪器

4～6周龄雄性BALB/c小鼠12只,购于江苏大学实验动物中心,合格证号:No.201926222；小鼠GC-1生精细胞株(广州吉妮欧生物科技有限公司)；L-DMEM、RPMI-1640、胰酶、胎牛血清均为美国Gibco公司产品；MTT试剂(美国Amrgsco公司)；二甲基亚砜溶液(上海生工公司)；Transwell小室(美国Corning公司)；双抗、BCA蛋白浓度检测试剂盒均购自上海碧云天公司；Annexin-V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(南京福麦斯公司)；成骨成脂诱导分化培养基试剂盒(美国Cyagen公司)；CD9兔抗小鼠单克隆抗体、CD63兔抗小鼠单克隆抗体(英国Abcam公司)；HRP标记羊抗兔IgG(上海爱必信公司)。CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；酶标仪(美国Biotek公司)。

1.2 细胞培养

用含10 %胎牛血清、100 U/mL 链霉素和100 U/mL青霉素的L-DMEM,于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养原代小鼠骨髓间质干细胞(mBMMSCs),用于收集培养上清液及提取mBMMSCs-EVs。

用含10%胎牛血清、100 U/mL链霉素和100 U/mL青霉素的RPMI-1640,于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养GC-1生精细胞。

1.3 mBMMSCs提取及鉴定

1.3.1 mBMMSCs提取 脱颈处理BALB/c小鼠,快速放至75%乙醇的烧杯内浸泡备用,取股骨和胫骨,冲出骨髓,将冲洗出来的细胞悬液收集于离心管中；在20 ℃条件下，600 r/min离心5 min；弃上清液,重悬细胞悬液并接种于培养瓶；置于37 ℃、5% CO2培养箱中按“1.2”方法培养。

1.3.2 mBMMSCs鉴定 利用流式细胞仪对mBMMSCs表面的CD29、CD44、Sca-1和CD117蛋白进行鉴定。使用成骨诱导分化培养基培养诱导成骨分化3周；PBS冲洗；4%中性甲醛溶液固定30 min；PBS冲洗；茜素红染色5 min。使用成脂诱导分化培养基和维持培养基交替培养诱导成脂分化2周；PBS冲洗；4%中性甲醛溶液固定30 min；PBS冲洗；油红O染料工作液染色30 min(工作液配制方法:油红O贮存液∶蒸馏水=3∶2)。

1.4 mBMMSCs-EVs提取及鉴定

1.4.1 mBMMSCs-EVs提取 待mBMMSCs生长至80%～90%融合度时,用无血清培养基培养48 h,收集上清液；于4 ℃行2 000×g离心20 min；4 ℃行100 000×g超速离心1 h；弃上清液；用PBS重悬沉淀,100 000×g再次超速离心1 h。

1.4.2 mBMMSCs-EVs形态观察及粒径检测 取10 μL mBMMSCs-EVs,充分混悬后滴加至铜网上,室温静置1 min,用滤纸吸去边缘液体；取醋酸双氧铀10 μL滴加于铜网上,室温静置1 min,用滤纸吸去边缘液体；干燥后置于透射电镜下观察mBMMSCs-EVs形态。取10 μL mBMMSCs-EVs用双蒸水稀释至30 μL；用标准品进行粒径分析仪器性能检测,合格后行mBMMSCs-EVs上样,进行梯度稀释避免样本堵塞进样针；对合适浓度的处于布朗运动中的mBMMSCs-EVs 进行捕捉和分析,即可获得mBMMSCs-EVs的粒径和浓度信息。

1.4.3 蛋白质印迹法检测mBMMSCs-EVs分子标志物CD9和CD63表达 取100 μL纯化后的mBMMSCs-EVs,与RIPA 裂解液等体积混匀,放置冰上10 min,振荡 1 min,重复操作3次；完全裂解后4 ℃、15 000×g离心15 min,取上清液,用 BCA 法测定其蛋白浓度。加入蛋白上样缓冲液,煮沸 8 min；缓慢加样行SDS-PAGE(150 V,45 min)；350 A恒流2 h,将蛋白转移至PVDF膜；脱脂奶粉封闭 2 h；分别加入CD9和CD63(1∶500)一抗孵育过夜；TBST 洗膜；加入HPR标记的山羊抗兔二抗(1∶2 000)室温孵育2 h；TBST洗膜3次；ECL 曝光显影。

1.5 MTT实验检测GC-1生精细胞增殖能力

生精细胞GC-1分别用含0、8、16、32 μg/mL尼古丁的RPMI-1640处理24 h；收集细胞,以2×103个/孔细胞密度接种于96孔板,设置4个时间点(0、24、48和72 h),每组设5个复孔；分别按照所设时间点,每孔加入20 μL MTT试剂(5 mg/mL)；4 h后加入150 μL二甲基亚砜溶液,置于摇床上低速振荡10 min,以确保结晶充分溶解；酶标仪测定490 nm波长处各孔光密度(D)值,并计算细胞活力。细胞增殖率(%)=(实验组D值-空白组D值)/(对照孔D值-空白组D值)×100%。另外,生精细胞GC-1用32 μg/mL 尼古丁预处理24、48、72 h后,分别用0、50、100、200 μg/mL 胞外囊泡处理24 h,步骤同上。筛选最适浓度的尼古丁和胞外囊泡进行后续实验。

1.6 GC-1生精细胞迁移及凋亡实验

1.6.1 细胞分组 将GC-1生精细胞分为对照组、尼古丁组和尼古丁+胞外囊泡组。对照组:常规培养；尼古丁组:32 μg/mL尼古丁预处理24 h后常规培养24 h；尼古丁+胞外囊泡组:32 μg/mL尼古丁预处理24 h后加入200 μg/mL 的mBMMSCs-EVs处理细胞24 h。

1.6.2 Transwell迁移实验检测GC-1生精细胞迁移能力 收集各组细胞,计数,先于下室中加入600 μL含10%胎牛血清的营养液,再以1×105/孔细胞重悬于200 μL无血清培养基中；将细胞悬液滴加于Transwell小室上室中,于37 ℃、5% CO2孵箱内培养8 h；吸干上室内液体,用棉签除去上室中未迁移细胞；PBS洗3～4遍；将小室于4%多聚甲醛中固定30 min；PBS洗3～4遍；结晶紫染色30 min；PBS洗3～4遍；随机选择3个视野,计算每个视野内的细胞迁移数并进行统计。

1.6.3 流式细胞仪检测GC-1生精细胞凋亡情况 收集各组细胞,用PBS洗涤2次,避光条件下用AnnexinV-FITC和PI染色30 min。用BD Accuri C6流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)对染色细胞进行流式细胞术分析。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 mBMMSCs的鉴定

通过流式细胞仪检测第3代处于对数生长期的mBMMSCs(图1A),此时标志物CD29、CD44和Sca-1呈阳性(>95%),CD117则呈阴性(<5%)。

经成骨诱导3周后,细胞慢慢由长梭形转变成不规则的多边形,茜素红染色后可以在镜下观察到胞质呈红色(图1B)。成脂诱导2周后,细胞逐渐转变成椭圆形,通过油红O染色可以观察到细胞胞质中布满橘红色的脂滴,脂滴具有较强的折光性(图1C)。由此说明,提取的细胞即为mBMMSCs。

2.2 mBMMSCs-EVs的观察和鉴定

由图2可见,通过透射电镜观察显示,mBMMSCs-EVs形态呈典型的“杯盘”状,粒径分布在30～200 nm,主要集中在110 nm附近。蛋白印迹法检测显示mBMMSCs-EVs表达CD9和CD63,由此提示成功分离mBMMSCs-EVs。

A:流式细胞术检测细胞标志物；B:成骨诱导分化(100×)；C:成脂诱导分化(200×)图1 小鼠骨髓间质干细胞的鉴定

A:透射电子显微镜观察mBMMSCs-EVs形态；B:纳米颗粒跟踪分析mBMMSCs-EVs粒径分布；C:蛋白质印迹检测mBMMSCs-EVs表面标志图2 小鼠间质干细胞来源的胞外囊泡的鉴定

2.3 mBMMSCs-EVs对尼古丁诱导损伤GC-1生精细胞增殖能力的影响

MTT实验结果显示(图3),与0 μg/mL尼古丁相比,32 μg/mL尼古丁作用24、48、72 h时GC-1生精细胞增殖能力明显降低(P<0.05或<0.01),8、16 μg/mL尼古丁作用24、48、72 h时组间差异无统计意义。由此确定24 h,32 μg/mL尼古丁作为最适作用时间和浓度。

由图3可见,与0 μg/mL胞外囊泡组相比,24、48、72 h时,200 μg/mL胞外囊泡组细胞增殖能力明显增加(P<0.05或<0.01)；48、72 h时,100 μg/mL胞外囊泡组细胞增殖能力增加,50、100 μg/mL胞外囊泡作用24 h及50 μg/mL胞外囊泡作用48、72 h时组间差异无统计学意义。由此说明,mBMMSCs-EVs可以逆转尼古丁对GC-1生精细胞增殖能力的抑制。因此,选择24 h,200 μg/mL mBMMSCs-EVs作为胞外囊泡修复尼古丁损伤GC-1生精细胞最适作用时间和浓度。

a:P<0.05,b:P<0.01,与同时间点0 μg/mL尼古丁组比较；c:P<0.05,d:P<0.01,与同时间点0 μg/mL胞外囊泡组比较图3 MTT实验检测各组处理不同时间后GC-1生精细胞的增殖能力

2.4 mBMMSCs-EVs对尼古丁诱导损伤GC-1细胞迁移能力的影响

Transwell迁移结果显示,与对照组相比,尼古丁组GC-1生精细胞迁移数明显减少(t=3.405,P<0.01)；尼古丁+胞外囊泡组的生精细胞迁移数量较尼古丁组明显增多(t=3.625,P<0.05),见图4。由此说明mBMMSCs-EVs可以部分逆转尼古丁对生精细胞迁移的抑制。

a:P<0.01,与对照组相比；b:P<0.05,与尼古丁组相比图4 Transwell迁移实验检测不同组GC-1生精细胞迁移能力(×100)

2.5 mBMMSCs-EVs对尼古丁诱导损伤GC-1细胞凋亡能力的影响

结果显示,与对照组相比,尼古丁组GC-1生精细胞凋亡率明显增高(t=13.010,P<0.01)；与尼古丁组相比,尼古丁+胞外囊泡组细胞凋亡率明显降低(t=5.889,P<0.01)。见图5。由此表明,mBMMSCs-EVs可以逆转尼古丁引起的GC-1生精细胞凋亡。

a:P<0.01,与对照组相比；b:P<0.01,与尼古丁组相比图5 流式细胞术检测各组GC-1生精细胞凋亡率

3 讨论

本研究采用生精细胞GC-1作为尼古丁诱导损伤生精模型；32 μg/mL尼古丁作用24 h时,GC-1细胞增殖率明显降低,200 μg/mL胞外囊泡作用尼古丁诱导损伤细胞24 h时,细胞增殖率明显增高。由此表明,mBMMSCs-EVs可以逆转尼古丁对GC-1生精细胞增殖能力的抑制。

本研究中,与尼古丁组相比,尼古丁+胞外囊泡组的细胞迁移数量明显增加、细胞凋亡数量明显减少,说明mBMMSCs-EVs可逆转尼古丁对GC-1生精细胞的迁移抑制和凋亡促进,可一定程度修复尼古丁对GC-1生精细胞的损伤。有研究表明,间充质干细胞可以促使心脏修复[12],促进烧伤创面再生[13]。mBMMSCs-EVs相较于间充质干细胞更利于制造储存,更具有生物活性[14],在受损的组织或细胞中,mBMMSCs-EVs可以替代间充质干细胞用于治疗并且更加优化[15]。例如,mBMMSCs-EVs治疗可修复受损的肾上腺组织,并使其功能得到较大程度的恢复[16],治疗人角膜内皮细胞可促使伤口愈合速度加快[17],本实验结果与其相一致。此外,有研究表明,人脐带间充质干细胞来源的胞外囊泡可促进施万细胞增殖和迁移，有助于受损的周围神经修复[18],这表明除mBMMSCs-EVs之外,其他来源的胞外囊泡也具有修复能力。

综上所述,本研究分离的mBMMSCs-EVs对尼古丁诱导的GC-1生精细胞损伤有一定的修复作用。目前关于mBMMSCs-EVs修复尼古丁诱导的生精细胞损伤的体内实验和潜在机制研究并不完善,有待后续进一步研究。