高效液相色谱法测定蓝莓提取物中 花色苷含量的测量不确定度评定

◎ 胡玉霞

（浙江经贸职业技术学院，浙江 杭州 310018）

蓝莓物种名为越橘，杜鹃花科越橘属植物（Vaccinium），是多年生灌木浆果果树，20世纪 80年代由美国引入，因其果实为蓝色而得名[1]。目前我国蓝莓种植省份多达27个，产量大于50000 t[2]。蓝莓水果营养价值高，可即食亦可深加工为果酱、果干、果汁等。蓝莓的深蓝色主要是因为其皮肉中富含花色苷，花色苷由花色素和糖以糖苷键结合而成，属黄酮类物质[3-5]，是一种有效的天然自由基清除剂，有抗氧化、抗衰老、抗癌等功效，在食品生产、生物制药、护肤品等领域有应用前景[6-8]。蓝莓中的花色苷主要集中在深色的皮肉中，然而在实际加工中，蓝莓渣大多却被作为废料处理，浪费了资源。要开发蓝莓渣深加工，变废为宝，就需要对蓝莓中花色苷的含量进行测定，而不确定度评定是衡量检测结果准确性的重要指标[9]。本文以蓝莓渣的提取物干粉为样品，应用高效液相色谱法，对其中最为常见的一种花色苷矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的含量进行不确定度评定，为蓝莓提取物中花色苷含量的检测方法提供不确定度参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇，HPLC；乙腈，HPLC；甲酸，GR；磷酸，GR；盐酸，GR；标准品：矢车菊素-3-O-葡萄糖苷氯化物，纯度99.9%；蓝莓提取物干粉（浙江蓝美生物）。

1.2 仪器与设备

ThermoU3000高效液相色谱仪配二级阵列检测 器；ME203E梅 特 勒 电 子 天 平（0.0001 g）；ZorbaxExtend-C18液相色谱柱。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

用分析天平称取花色苷矢车菊素葡萄糖苷标准品0.08 g，用2%（V/V）盐酸甲醇溶解，超声15 min使之完全溶解，定容至20 mL即得400 μg·mL-1标准原液（-20 ℃保存7个月）。用移液管移取标准原液5 mL至25 mL的容量瓶中，用10%（V/V）磷酸水溶液定容即得80 μg·mL-1标准使用溶液（-20 ℃保存 30 d）。

1.3.2 样品处理

用分析天平准确称取0.125 g样品倒入25 mL的容量瓶中，用2%（V/V）盐酸甲醇约15 mL溶解，超声处理15 min，置冷后定容。用移液管移取上述溶液5～25 mL的容量瓶中，用10%（V/V）磷酸水溶液定容，过0.45 μm滤膜，待液相色谱分析。

1.3.3 液相色谱条件

选用ZorbaxExtend-C18液相色谱柱，二级阵列检测器，检测波长535 nm，柱温30 ℃，流速1 mL·min-1，流动相A（10%甲酸水溶液）和流动相B（甲酸∶水∶乙腈∶甲醇=40∶160∶90∶90），梯度洗脱条件见表1。

表1 液相色谱流动相梯度洗脱条件表

1.4 建立数学模型

1.4.1 检测程序

称取分析试样，质量用m表示；用一定体积2%盐酸甲醇溶液超声处理，定容V1；分取V2，用10%磷酸水溶液稀释定容至V3；试样液及标准品过膜经HPLC分析测定，得到样液中矢车菊素葡萄糖苷含量c；计算样品中矢车菊素葡萄糖苷含量x。

1.4.2 数学模型

蓝莓提取物样品中矢车菊素葡萄糖苷含量检测的数学模型：

式中：x-试样中矢车菊素葡萄糖苷含量，g·kg-1；c-处理样液中矢车菊素葡萄糖苷的浓度，μg·mL-1；m-称取试样质量，g；V1-称取样品定容体积，mL；V2-分取体积，mL；V3-分取样品定容体积，mL；frep-重复性系数，由实验中各种随机因素产生，数值上为1。

2 结果与分析

2.1 不确定度来源

由检测程序和数学模型可知，检验过程中产生的不确定度主要包括称样过程、样液定容过程、样液稀释过程、标液配制过程、色谱仪器检测过程和样品平行测定的不确定度6个部分，详见图1。

图1 不确定度来源分析图

2.2 不确定度分量评定

2.2.1 样品称量导致的不确定度urel（m）

称量所用万分之一分析天平的最大允许误差是±0.0001 g，服从均匀分布k=，故电子天平称取0.125 g样品过程导致的相对不确定度为：

2.2.2 样液定容导致的不确定度urel(v1)

（1）定容体积产生的标准不确定度。样品称量后定容至25 mL容量瓶，根据《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）[10]A级容量允差±0.03 mL，按均匀分布取。

（2）定容温度变化所产生的标准不确定度。实验室环境温度为常温（20±5）℃，容量瓶检定温度为20 ℃，此时水的膨胀系数是0.0018 /℃，取均匀分布则。

样品定容时导致的合成不确定度为：

相对标准不确定度为：

2.2.3 样液稀释产生的不确定度urel（V2-3）

（1）移液管分取样液产生的标准不确定度。用单标线移液管移取5 mL样液，其容量允差为±0.015 mL，按均匀分布取。

（2）定容产生的不确定度。稀释定容至25 mL，不确定度由容量瓶容积和温度变化两部分组成，计算同2.2.2：

样液稀释导致的合成不确定度：

样品稀释导致的相对不确定度：

2.2.4 标液配制过程导致的不确定度urel(s)

（1）标准物质引入的不确定度。所购买的标品矢车菊素葡萄糖苷纯度为99.9%，出厂标物证书标示其相对标准不确定度为±0.2%，k=2，属正态分布，则由标准品纯度导致的相对不确定度为：

（2）标样称量引入的不确定度。标准品称样量为0.08 g，析天平的最大允许误差是±0.0001 g，服从均匀分布，标品称量产生的相对不确定度为：

（3）标样定容引入的不确定度。标准品定容过程产生的不确定度来自定容的容量瓶和温度变化，计算方法同2.2.2，标品定容至20 mL，20 mL容量瓶的最大允差为±0.03 mL，试验温度为（20±5）℃，经计算得urel(v2-3)=0.00527。

（4）标样稀释引入的不确定度。标样稀释过程同样品稀释过程2.2.3，则

（5）标液配制过程产生的总相对不确定度。计算如下：

2.2.5 液相色谱仪产生的不确定度urel(q)

根据高效液相色谱仪校准证书，液相色谱仪产生的不确定度为urel(q)=0.002。

2.2.6 样品测定重复性引入的不确定度urel(frep)

样品检验过程中重复实验产生的不确定度主要包括样品的均匀性、试剂的纯度、天平和移液管、容量瓶的重复性等构成，具有随机性，属于A类不确定度，对同一样品，测定6平行，求相对标准偏差，详见表2。样品重复测定产生相对不确定度为urel(frep)=RSD=0.00323。

表2 蓝莓粉中花色苷矢车菊素葡萄糖苷的含量表（n=6）

2.3 合成相对不确定度urel(y)

蓝莓提取物中花色苷矢车菊素葡萄糖苷含量测定不确定度的来源及各分量的测定结果见表3，根据《化学分析中不确定度的评估指南》（CNAS-GL006:2019）[11]， 高效液相色谱花色苷矢车菊素测定的总合成相对标准不确定度为：

表3 花色苷矢车菊素葡萄糖苷测定中各分量的 相对不确定度表

2.4 扩展不确定度评定

样品中花色苷矢车菊素的含量为77.34 g·kg-1，在95%置信区间，包含因子k=2，则相对扩展不确定度u(y)=2×0.0112=0.0224，矢车菊素葡萄糖苷的扩展不确定度为：U(Y)=77.34×0.0226=1.73 g·kg-1。

2.5 测量不确定度结果报告

用高效液相色谱法测定蓝莓粉中花色苷矢车菊素葡萄糖苷，当检测结果为77.34 g·kg-1时，描述为x=（77.34±1.73）g·kg-1；k=2，置信区间95%。

3 结论

本实验对花色苷矢车菊素葡萄糖苷检测过程中可能产生不确定度的6个环节进行计算分析。由表3可知液相色谱测定蓝莓提取物中花色苷矢车菊素的不确定度主要来自标准溶液的配制过程，其贡献率达到31.73%，其次是样品提取的定容和稀释过程，均占22.17%，其他因素的影响相对较小。在用此方法测定蓝莓提取物中花色苷矢车菊素葡萄糖苷的过程中，为控制测定的不确定度，应控制的关键环节主要是标准溶液的配制和样品处理过程，如尽量选择合适浓度的标准溶液，让标液浓度与检测样液浓度接近以减小定量误差，提高结果的准确性；样品前处理过程中，注意取样均匀，选取检定合格的玻璃量器，并规范操作，以确保实验结果的精密度和准确度。本实验样品处理方法简单，未考虑加标回收过程不确定度的贡献，且用单标定量，未考虑标曲拟合过程的不确定度，这些都需要日后继续研究。