液相色谱-柱后衍生-原子荧光联用测定 食品中硒形态

◎ 谢佩文

（广东亨盛维嘉食品工业有限公司，广东 潮州 515726）

硒作为动物与人类必需微量元素，是合成硒蛋白，包含硫氧蛋白还原酶、谷胱甘肽过氧化酶、碘甲状腺素脱碘酶的关键组成部分，对于甲状腺激素代谢、繁殖、免疫力与抗氧化具有良好生物学功能。人体如果缺少硒元素，会降低人体免疫力，增加患癌症与死亡风险。根据营养学会推荐，成人摄硒量每天为50～250 μg，不能超过400 μg，摄入800 μg会出现人体中毒症状。硒元素多用于食品功能成分，特别是人们生活水平得到提高后，对硒产品的需求量也逐渐增加，但硒元素过量摄入会对人体造成危害，健康硒食品发展中，也需明确硒是把“双刃剑”[1]。本文采取液相色谱-柱后衍生-原子荧光联用方式，分析食品硒形态，推动硒产品实现规范发展。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 仪器与设备

液相色谱-原子荧光联用仪AS-53（广西路博环保科技有限公司）；纯水机Direct-Pure（北京中程瑞源科技有限公司）；分析天平LE204E/02（上海赞维衡器有限公司）；超声水浴（济南欧莱博电子商务有限公司）；抽滤设备（青岛精诚仪器仪表有限公司）；超声波清洗器KH3200B（青岛明博环保科技有限公司）。

1.1.2 材料与试剂

硒形态标准品：甲基硒代半胱氨酸（96%纯度）；硒代胱氨酸（98%纯度）；亚硒酸钠（99%纯度）；硒代蛋氨酸（99%纯度），用超纯水配制上述标准品为1 mg·L-1浓度溶液，放置于4 ℃下进行保存，配制溶液及处理样品均使用超纯水；硼氢化钠、碘化钾、氢氧化钠、柠檬酸以及磷酸氢二胺，均为分析纯（上海宏瑞化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

（1）碘化钾碱溶液。氢氧化钠称取2.90 g倒入烧杯，以少量水溶解添加1 g碘化钾，加水超声溶解，稀释定容至1000 mL。

（2）硼氢化钠还原剂。盐酸称取100 mL，以水稀释定容至1000 mL。

（3）超纯水溶液。称取超纯水1 L后，超声脱气待用，根据实际以磷酸、氨水进行调节pH=8.0。

1.2.2 仪器色谱条件

（1）色谱条件。使用Hamilton 10 μm阴离子色谱柱，利用磷酸氢二胺、硼氢化钠流动相分离硒形态。

（2）仪器条件。80 mA灯电流；270 V负高压；500 L·min-1载气流量；7 mm原子化器高度；1000 L·min-1屏蔽气流量；2根15 W紫外灯；60 r·min-1泵速A； 70 r·min-1泵速B；300 ℃原子化器温度。

1.2.3 样品预处理

称取1.00 g样品放置在25 mL锥形瓶内，添加链霉蛋白酶E 10 mg溶于水，放入离心管内均匀混合，设置温度37 ℃完成超声提取，以60 r·min-1离心 30 min，取上清液通过有机膜过滤[2]。

1.2.4 方法条件

进样量满杯100 μL，开启紫外小结，流动相A为超纯水；流动相B为磷酸氢二胺溶液170 mol·L-1、 160 mol·L-1、150 mol·L-1，利用磷酸调节pH=6.3；流动相C为柠檬酸。衍生剂为300 mL·h-1碘化钾碱溶液；500 mL·h-1盐酸载流溶液；300 mL·h-1空气；300 mL·h-1硼氢化钠还原剂[3]。

2 结果与分析

2.1 优化仪器条件

2.1.1 选择流动相

流动相选择对分离目标化合物十分重要，硒形态分析流动相常见有醋酸盐、柠檬酸、Tris缓冲液及磷酸盐等，添加甲醇有花粉粒效果，综合分析硒化合物性质，采取阴离子色谱交换柱，探究柠檬酸与磷酸氢二胺为流动相的分离硒形态，发现以柠檬酸为流动相，降低了硒代蛋氨酸灵敏度，重复性差，甚至实验不会出峰，使用磷酸氢二胺溶液可避免上述缺陷，采取磷酸氢二胺成为流动相，硒形态分离中20 min即可达到基线。

2.1.2 选择流动相浓度

流动相浓度分析中，分析磷酸氢二胺170 mmol·L-1、160 mmol·L-1、150 mmol·L-1，pH=6.3的溶液分离硒形态效果，发现溶液浓度是150 mmol·L-1时，灵敏度较低，出峰时间是27 min，时间较长；浓度是170 mmol·L-1时，显示亚硒酸跟与甲基硒代胱氨酸峰值无法达到分离基线；浓度160 mmol·L-1时，分离硒形态效果更好，以此作为流动相浓度。

2.1.3 流动相pH值

考察流动相不同pH值对硒形态分离影响。流动相pH≤6.0时，未能检测亚硒酸钠响应值，逐步增加流动相pH值，pH=6.3可实现硒形态分离，缩短时间至24 min；将流动相pH值继续提高至pH=6.8时，分离硒代蛋氨酸、甲基硒代半胱氨酸程度降低。所以，选择最佳流动相pH=6.3，且流动相pH=6.3时，4种硒形态均可分离，且甲基硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸、亚硒酸钠以及硒代蛋氨酸的保留时间分别是 15.771 min、14.434 min、10.317 min以及5.381 min。

2.2 线性关系及检出限

称取硒代半胱氨酸0.0202 g，硒代胱氨酸0.0242 g、 亚硒酸钠0.0234 g以及硒代蛋氨酸0.0226 g定容为100 mL，配制10～200 μg·L-1系列标准溶液，根据 1.2方法操作测定，以硒化合物浓度为纵坐标，横坐标为对应峰面积绘制标准曲线，获得方法线性关系及检出限，结果如表1所示。

表1 4种硒形态线性关系与检出限化合物表

结果表明方法在硒化合物浓度为10～200 μg·L-1时线性关系良好，相关系数均大于0.99，检出限处于2.16～3.78 μg•L-1。4种 硒 化 合 物 色 谱 图 如 图1 所示。

图1 硒形态色谱图

2.3 精密度

精密度测试中，以配制的标准浓度试剂进行平行试验，可获得精密度。由试验结果可知，甲基硒代半胱氨酸的精密度是3.6%，硒代胱氨酸精密度是2.8%，亚硒酸钠精密度是3.2%，硒代蛋氨酸精密度是4.3%，均低于5%，满足试验需求。

2.4 加标回收率

选择富硒大米不同硒含量作为试验样品，测定总硒含量是1.25 mg·kg-1，测试样品不同形态下硒本底值，完成加标回收试验，对3个浓度加标回收，不同浓度进行6个平行试验，结果表明硒形态加标回收率为86.3%～104.4%，相对标准偏差低于5.0%， 见表2。

表2 加标回收率表（n=6）

2.5 样品测定

本实验中采取液相色谱-柱后衍生-原子荧光联用方式测定富硒大米的有机硒形态，根据结果可知，富硒大米内仅检出有硒代蛋氨酸。

3 结论

硒作为典型双功能元素，是人体必需微量元素的同时，也存在毒性。硒具有抗氧化、抗癌、增强人体免疫力等作用，可对维生素利用与吸收进行调节，且参与调节合成蛋白质。人体如果长期缺硒会引发大骨节病、心脑血管疾病、糖尿病与克山病等[4]。而摄入硒过量超出安全阈值，也会损害人体，引发慢性或急性硒中毒，因此合理、科学摄入硒元素具有重要的作用。硒化合物形态多样，且硒不同形态生物效应、功能、毒性存在差异，不能仅测定硒总含量，还需分析食品硒形态[5]。食品不同，性质也不同，硒蛋白形态与种类较为复杂，为迅速测定硒形态，本文结合硒的化学和物理性质，通过使用液相色谱-柱后衍生-原子荧光联用的方式测定硒形态，对食品硒形态进行定量定性分析，精确度较高，可满足测定要求。