基于GEO 数据库甲状腺相关性眼病差异基因免疫浸润机制研究

尹谢添 赵诗超 向 楠 陈继东,5 曾明星 周广文

1.湖北中医药大学第一临床学院，湖北武汉 430061；2.湖北省中医院风湿免疫科，湖北武汉 430061；3.向楠名医工作室，湖北武汉 430061；4.湖北省中医院老年病科，湖北武汉 430061；5.湖北省中医院内分泌科，湖北武汉 430061；6.湖北中医药大学基础医学院，湖北武汉 430061；7.湖北中医药大学针灸骨伤学院，湖北武汉 430061

甲状腺相关性眼病（thyroid-associated ophthal mopathy，TAO），又称为格雷夫斯眼病（Graves’disease，GD）和甲状腺眼病是一种以眼球后及眼眶周围组织浸润性病变为特征的自身免疫性疾病。TAO 以40～60 岁女性多发，男女患病比例为1∶5[1]，总发病率约为0.0422‰[2]。20%～50%的格雷夫斯病患者有眼部受累表现[3]，其中5.0%～8.6%的患者会发展成严重阶段[4]，如导致甲状腺功能障碍性视神经病变（dysthyroid optic neuropathy，DON）和暴露性角膜溃疡等[5]。TAO 临床症状轻者以眼睛充血、畏光、流泪、异物感、疼痛为主要表现；临床症状重者以眼睑闭合不全、复视、眼球运动障碍、失明为主要表现[6]。其治疗包括基本治疗（戒烟、眼睛局部治疗），维持甲状腺功能稳定治疗，针对突眼治疗（糖皮质激素、免疫抑制剂、硒剂、利妥昔单抗、妥珠单抗、放射治疗、手术治疗）和中草药治疗等[7]。本病对患者生活质量、精神状况常造成重大影响。TAO 发病机制复杂，目前认为其病因病机主要与环境因素、遗传因素和免疫因素有关，尤其是免疫因素常被认为是TAO 发生和进展的核心因素[8]。为了明确其相关免疫机制设计本研究，以期通过数据挖掘的方式得出相关结论，以便未来能够更好地为临床服务。

1 资料与方法

1.1 TAO 差异表达基因获取与热图、火山图绘制

使用GEO 数据库进行检索，搜索“Graves disease”，物种限制为人，对基因芯片数据进行筛选。选定TAO 前眼眶表达基因作为试验组，正常人前眼眶表达基因作为对照组。使用R 软件，设定P ＜0.05，log FC＞0.5，进行差异基因分析，正数代表上调，负数代表下调，获取上调和下调最显著的前20 个基因绘制热图，同时绘制火山图，并将所得的差异基因导入表格中。

1.2 核心的差异基因获取

将得到的两组差异基因导入STRING 数据库中，选定物种为人，设定作用阈值“highest confidence=0.900”，隐藏网络中离散的点，默认其余参数，得出差异基因的蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络。同时，对该PPI 网络进行分析，计算degree 值，其值越高提示该节点在网络中的地位越核心，并以图形展示结果。

1.3 差异基因的GO 和KEGG 富集分析

通过R 软件，将上述差异基因进行GO 富集分析和KEGG 富集分析。设置筛选条件为P value Cutoff＜0.05 显示排名靠前的10 条GO 生物过程和20 条KEGG通路，绘制柱状图及气泡图。

1.4 获取免疫浸润矩阵

CIBERSORT 反卷积算法是基于线性支持向量回归的机器学习方法，是一种用于评估组织中22 种免疫细胞占比的计算方法。实验基于R 软件，链接CIBERSORT 反卷积法进行B 细胞、浆细胞、T 细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等22 种免疫细胞的转录特征矩阵模拟计算，计算次数设置在100 次，对P ＜0.05 的数据进行分析。

1.5 免疫细胞间的相关性分析和组间差异分析

将上述在CIBERSORT 反卷积法中得到的P ＜0.05的可信样本数据通过R 软件进行不同免疫细胞间的相关系数计算，以分析试验组和对照组组间的差异性及各免疫细胞间的相关性。

2 结果

2.1 TAO 差异表达基因获取结果

从GEO 数据库中下载GSE58331 芯片数据与GPL570 平台数据，共175 个样本。经过筛选，获得试验组TAO 前眼眶表达基因22 个样本，对照组正常人前眼眶表达基因20 个样本。通过R 软件进行相关分析，获取两者间差异基因315 个，其中下调基因220 个，上调基因95 个，并选取差异最明显的前20 个基因绘制热图（图1），同时绘制火山图（图2）。

图1 正常组与试验组差异基因热图（见内文第34 页）

图2 正常组与试验组差异基因火山图（见内文第34 页）

2.2 核心差异基因获取结果

使用STRING 数据库对差异基因进行PPI 分析。在PPI 网络中，有节点289 个，边197 条，平均节点degree 值为1.36。该网络中大于2 倍平均节点degree值的核心基因有56 个，其中degree 值最高的核心差异基因前5 位分别是FOS、JUN、CXCL8、ITGAM 和CXCL12。见图3～4。

图3 核心差异基因的PPI 网络

图4 PPI 网络中核心差异基因degree 值排序

2.3 差异基因的GO 和KEGG 富集分析结果

使用R 软件，根据TAO 差异表达基因，进行生物学功能和通路富集分析。其中生物过程有460 条，细胞成分有6 条，分子功能有36 条，KEGG 通路有20 条。根据基因富集数目与显著程度，选取排名靠前的前10 条BP、CC、MF 和20 条KEGG 通路分别绘制柱状图和气泡图，见图5～6。其中涉及的生物过程和KEGG 信号通路均与免疫炎症关系密切，如图中所示，主要包括细胞趋化性、白细胞趋化性、白细胞迁移、粒细胞趋化性、单核细胞迁移等GO 生物过程和破骨细胞分化、细胞因子-细胞因子受体相互作用、PI3K-Akt 信号通路、白细胞介素（interleukin-IL）-17信号通路、NF-κB 信号通路、Toll 样受体信号通路等KEGG 通路。

图5 甲状腺相关性眼病差异基因GO 富集分析（见内文第35 页）

图6 甲状腺相关性眼病差异基因KEGG 富集分析（见内文第35 页）

2.4 免疫浸润矩阵获取结果

在CIBERSORT 反卷积法中以P ＜0.05 对TAO与正常人群的前眼眶基因样本进行筛选，最终获得27 个可信样本，其中试验组13 个，对照组14 个，试验组用橙色表示，对照组用蓝色表示。结果显示，M2巨噬细胞、未活化的静息肥大细胞在TAO 试验组中显著减少，而单核细胞、浆细胞、中性粒细胞等在TAO试验组中显著增加，见图7。同时予以免疫细胞比例箱图进一步显示22 种免疫细胞在各样本中的浸润比例，见图8。

2.5 免疫细胞相关性分析

如图9 所示，浆细胞和活化的肥大细胞呈显著正相关（r=0.64），单核细胞和中性粒细胞呈显著正相关（r=0.61），未活化的自然杀伤细胞和中性粒细胞呈显著正相关（r=0.62），调节性T 细胞和CD8+T细胞呈显著正相关（r=0.60）。并且，未活化的静息肥大细胞和浆细胞呈显著负相关（r=-0.72），未活化的静息肥大细胞和活化的肥大细胞呈显著负相关（r=-0.68），单核细胞和M2 巨噬细胞呈显著负相关（r=-0.71），单核细胞和未活化的静息肥大细胞呈显著负相关（r=-0.66），未活化的自然杀伤细胞和活化的自然杀伤细胞呈显著负相关（r=-0.71）。见图9。

2.6 TAO 试验组与对照组免疫浸润差异分析

通过小提琴图对试验组与对照组组间的免疫浸润细胞行差异分析，以P ＜0.05 为差异有显著性，试验组用红色表示，对照组用蓝色表示，得出在试验组中单核细胞（P=0.014）和中性粒细胞（P=0.006）显著增高，而M2 巨噬细胞（P=0.019）和未活化的静息肥大细胞（P=0.039）显著减少的结论，见图10。

3 讨论

TAO 是一种病因病机复杂且治疗效果欠佳的自身免疫性疾病。随着目前对其越来越深入的研究，其遗传及免疫因素和抗免疫治疗越来越受到临床重视。本研究通过将TAO 和正常人的前眼眶表达基因进行差异分析，并将得到的差异基因导入STRING 数据库中进行PPI 分析，共筛选得到与TAO 相关的以FOS、JUN、CXCL8、ITGAM 和CXCL12 为首的56 个核心基因。FOS 与JUN 可能都与细胞凋亡有关。FOS 家族由c-FOS、FOSB、Fra-1、Fra-2 等成员组成，这些基因编码亮氨酸拉链蛋白，JUN 家族由c-Jun、JunB、JunD 等成员组成，c-Jun 是Fas 的转录激活因子，FOS 家族与JUN 家族的蛋白质二聚，从而形成转录因子复合物激活蛋白-1[9]。FOS 蛋白常被认为是细胞增殖、分化和转化的调节因子。某些情况下，FOS 基因的表达与凋亡细胞死亡有关。有研究证实，甲状腺癌增殖转化过程与c-FOS 及Fra-1 激活密不可分[10-13]。JUN 家族在细胞凋亡调节方面具有双向作用[14]。有研究证实硼替佐米可磷酸化并激活c-Jun，同时激活Fas 凋亡途径，促进甲状腺癌细胞凋亡[15]。趋化因子是一类由细胞分泌的具有化学趋化作用的信号蛋白或小细胞因子，其具有诱导附近反应细胞定向趋化的能力[16]。CXCL8 属于促炎趋化因子，主要是中性粒细胞的趋化剂，其在病理条件下形成，并积极参与炎症反应，吸引免疫细胞到炎症部位，同时也有证据表明CXCL8 具有抑制肥大细胞的作用[17-18]。有研究证实CXCL8 的表达水平检测，可作为TAO 活动性、病情严重程度和眼表功能评估的辅助诊断依据[19]。ITGAM 编码白细胞黏附分子β2，是白细胞黏附分子整合素β2 亚家族成员，主要介导细胞向炎症部位的黏附与迁移，和肿瘤的侵袭及转移密切相关[20]。有研究证实ITGAM 与系统性红斑狼疮的发生发展相关，与其免疫过程亦相关[21-22]。CXCL12属于体内平衡趋化因子，在某些组织中产生，负责基础白细胞迁移，同时骨髓中生成的CXCL12 能促进骨髓微环境中B 祖细胞增殖。而CXCL12 可能在甲状腺乳头癌侵袭、转移过程中起重要作用[23-24]。本研究所筛选的PPI 主要核心基因均与TAO 免疫细胞炎性浸润和迁移黏附有关，并与细胞凋亡相关，这和TAO 的发生发展过程相符，进一步说明预测的可靠性。

本研究利用GEO 基因芯片对TAO 和正常人的前眼眶组织进行差异基因的GO 和KEGG 富集分析，提示本病的生物学过程与免疫调节密切相关。其中BP 富集主要涉及细胞趋化性、白细胞趋化性、白细胞迁移、粒细胞趋化性、单核细胞迁移等，进一步显示TAO 是由多种炎症细胞因子共同参与的免疫过程。炎症细胞因子是指由免疫细胞（T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、自然杀伤细胞、单核巨噬细胞等）和非免疫细胞（纤维母细胞、表皮细胞、内皮细胞等）经刺激而合成分泌的一类具有生物学活性的小分子物质，其可通过结合相应受体来调控免疫应答与调节细胞生长分化[25]。近年来一系列研究证实[26-28]炎症细胞和细胞因子与TAO 有一定的关系。KEGG 分析显示，差异基因的相关通路与破骨细胞分化、细胞因子-细胞因子受体相互作用、PI3K-Akt 信号通路、IL-17 信号通路、NF-κB信号通路、Toll 样受体信号通路等密切相关。破骨细胞分化与甲状腺疾病导致的骨质疏松有关[29-31]，可能与TAO 的发生发展相关。细胞因子-细胞因子受体相互作用与TAO 的免疫调节有关[32-33]，贯穿在TAO 发生发展之中。PI3K-Akt 信号通路在调节细胞代谢、生长、增殖、存活、转录及蛋白质合成等方面发挥重要作用，该通路活性不仅能导致细胞恶性转化，而且与细胞的迁移、黏附、血管增生以及细胞外基质的降解等密切相关[34-35]，这均与TAO 的发生发展有关。IL-17 信号通路与TAO 的病情严重性相关，有研究证实IL-17有望作为TAO 病情活动性的评价新指标[36-39]。NF-κB信号通路在调节对感染的免疫应答中起关键作用，其不正确调节与癌症、自身免疫病和炎症有关，有研究[40]证实NF-κB1 基因启动子区域的多态性可能与TAO的发病具有相关性。Toll 样受体属于固有免疫病原模式识别受体，可以识别入侵人体的多种物质，最终导致机体产生促炎性细胞因子、抗炎症细胞因子和趋化因子，在炎症、免疫细胞调控、存活和增殖等方面发挥着重要作用，有研究[41]证实TLR9 激活后，可诱导活动期TAO 眼眶成纤维细胞合成和分泌炎症因子，表明TLR9 可能参与了TAO 活动期眼眶炎症反应过程。以上多种通路提示TAO 病情的发生发展均与炎症和免疫相关。

为进一步探讨免疫细胞在TAO 中的作用，利用CIBERSORT 反卷积法对两组前眼眶表达基因样本进行筛选，结果显示，在TAO 组中单核细胞和中性粒细胞显著增高，而M2 巨噬细胞和未活化的静息肥大细胞显著减少。在免疫细胞相关性分析中，将22 种免疫细胞两两比较，结果显示，单核细胞和中性粒细胞呈显著正相关，单核细胞和M2 巨噬细胞呈显著负相关，单核细胞和未活化的静息肥大细胞呈显著负相关，未活化的静息肥大细胞和活化的肥大细胞呈显著负相关，以上关系从侧面反应了不同的免疫细胞之间在TAO 病程进展过程中存在协同或拮抗作用。本研究预测的结果得到了相关研究的证实，Van 等[42]认为眼眶浸润的肥大细胞、单核细胞在TAO 中参与了眼眶成纤维细胞的活化，张灵丽等[43]认为TAO 患者外周血中性粒细胞/淋巴细胞较对照组升高，且升高程度与病情活动性有关，骆立夫等[44]认为TAO 眼眶脂肪结缔组织中存在大量炎症细胞和免疫细胞浸润（以淋巴细胞为主）与成纤维细胞增生。

综上所述，TAO 是一种甲状腺器官特异的自身免疫性疾病，免疫学发病机制在其发生发展过程中占据最重要地位，同时炎症反应也是其重要的发病机制，目前其药物治疗的主要方向即抗免疫和抗炎治疗，故对免疫学发病机制深入研究有助于指导TAO 患者的诊断、治疗和预后评价。本研究利用生物信息学对TAO前眼眶表达基因芯片进行生物学过程和免疫浸润分析，对后续相关科研工作具有一定参考意义。