GLP-1受体激动剂对糖尿病动脉粥样硬化大鼠microRNA-155及Toll样受体4表达的影响*

郭丽婷 葛焕琦 郑 辉 王 帆 刘天文

泰达国际心血管病医院,天津市 300457

心肌梗死、卒中等动脉粥样硬化事件是2型糖尿病患者最主要的死亡原因。近年来，研究显示炎症在动脉粥样硬化的发病机制中起着重要作用。其中，microRNA-155(miR-155)作为典型的多功能miRNAs分子之一，在炎症、免疫的调控中发挥重要作用。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂利拉鲁肽作为降糖药已广泛应用于临床。最新研究显示，利拉鲁肽在改善血糖外亦有多种获益，引起学术界的重点关注。研究显示，利拉鲁肽可以改善糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠的胰岛素抵抗并减轻肝脏氧化应激损伤[1]。另一研究显示，利拉鲁肽可以减轻糖尿病小鼠动脉粥样硬化病变程度[2]。目前，利拉鲁肽在改善动脉粥样硬化及抑制炎症中的具体机制尚不清楚。因此，本研究以高脂饮食联合链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病动脉粥样硬化大鼠模型为研究对象，观察利拉鲁肽对动脉粥样硬化大鼠miR-155水平及TLR4/NF-κB表达的影响。

1 材料和方法

1.1 材料 利拉鲁肽(诺和诺德中国制药有限公司)，SD大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，高脂饲料(北京科澳协力饲料有限公司)，STZ(美国Sigma公司)，qPCR引物购自北京擎科公司，血糖仪和试纸(德国拜耳)，El-800全自动生化分析仪(PE公司，USA)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物:8周龄雄性SD大鼠40只，体重200～220g，适应性喂养1周后随机分为对照组(NC,n=10)给予普通饮食和高脂饮食组(HFD,n=30)给予高脂饮食。高脂饲料配比：55.7%的普通饲料，12%猪油，20%蔗糖，10%蛋黄粉，2%胆固醇，0.3%胆酸盐。6周后，HFD组一次性腹腔注射STZ(30mg/kg)，给药后第3天和第7天分别测内眦血血糖，均>16.7mmol/L认为2型糖尿病动脉粥样硬化模型成功。模型大鼠随机分为糖尿病组(DM)、利拉鲁肽中剂量组[M-Lir, 200μg/(kg·d)，皮下注射]和利拉鲁肽大剂量组[H-Lir, 400μg/(kg·d)，皮下注射][2-3]，每组10只，对照组和糖尿病组给予等量柠檬酸缓冲液，干预8周。

1.2.2 取血和主动脉组织：用3%戊巴比妥钠麻醉，采集心脏血液用于测定TC、TG、LDL-C和 FBG。取主动脉根部病变组织，切成2mm长的血管环备用。

1.2.3 qRT-PCT检测：(1)组织总RNA的提取：取-80℃冰箱中保存的新鲜冰冻组织，重量约为100mg，Trizol法提取总 RNA(按说明书操作)，用微量分光光度计测定OD260、OD280以及OD260/OD280值，计算RNA的纯度和浓度。(2)检测目的基因表达水平：逆转录反应体系(其中miR-155采用茎环法)，RNA 5μg,Oligo(dT)2μl,dNTP 4μl,5×buffer 4μl,逆转录酶1μl,RNase inhibitor 0.5μl,加DEPC水补至20μl,(其中miR-155引物为Loop primer),25℃ 5min，50℃ 15min，85℃ 5min，4℃ 10min，产物 cDNA保存于-20℃。(3)荧光定量PCR反应体系(cDNA 稀释5倍),SYBR Green Master Mix 10μl,上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，cDNA 4μl，ROX 0.4μl，DEPC水4.8μl,50℃ 2min，95℃ 10min；95℃ 30sec，60℃ 30sec，×40个循环。(4)QPCR产物的相对定量分析 ：采用2-△△Ct法进行数据的相对定量分析。

2 结果

2.1 利拉鲁肽对糖尿病大鼠生化指标的影响 糖尿病组大鼠FBG、TC、TG、LDL-C水平均高于对照组(P<0.01)；体重明显下降(P<0.01)；利拉鲁肽中、大剂量干预组，FBG、TC、TG、LDL-C水平均低于糖尿病组(P<0.05)，体重未再继续下降，而略有增加，与利拉鲁肽干预后血糖下降及“三多一少”症状改善有关，见表1。

表1 利拉鲁肽干预8周对糖尿病动脉粥样硬化大鼠生化指标的影响

2.2 利拉鲁肽对糖尿病大鼠动脉粥样硬化病变部位炎症基因表达的影响 与对照组相比，糖尿病组大鼠主动脉粥样硬化部位miR-155、TLR4和NF-κB mRNA表达显著升高(P<0.01)；与糖尿病组相比，利拉鲁肽中、大剂量组miR-155和TLR4、NF-κB mRNA水平显著下降(P<0.05)，且利拉鲁肽大剂量组三者降低更显著，尤其是对TLR4和NF-κB mRNA减低更明显(P<0.01)，见表2。

表2 利拉鲁肽对糖尿病大鼠动脉粥样硬化组织miR-155、TLR4和NF-κBmRNA表达的影响

3 讨论

动脉粥样硬化是血管系统的慢性炎症性疾病, 由血管壁多种细胞与多种炎症因子相互作用的结果。越来越多的研究显示，TLR4/NF-κB炎症通路在人动脉粥样硬化斑块中高度活跃，密切参与动脉粥样硬化的发生、发展[4]。近年研究显示，miR-155作为新型炎性调节因子，与TLR4/NF-κB通路的关系错综复杂。首先，TLR4激活后通过髓样分化因子88(MyD88)/TRIF信号通路促进NF-κB活化，NF-κB与miR-155HG启动子结合，增加成熟miR-155表达，反过来miR-155又通过负反馈抑制MyD88、IKKs的表达，增强NF-κB活性，激发炎性瀑布反应，进而损伤血管内皮细胞，导致动脉粥样硬化形成[5]。Kovacs等研究显示，糖尿病大鼠视网膜细胞miR-155、miR-146表达增加，促进NF-κB活性，介导促炎因子释放，从而导致血管炎症发生[6]。另一研究也显示，miR-155促进NF-κB通路大量激活，影响肿瘤坏死因子-α、白介素-6等炎症因子释放，增加巨噬细胞摄取氧化型低密度脂蛋白，导致泡沫细胞形成[7]。本研究显示：糖尿病大鼠主动脉粥样硬化病变组织miR-155水平升高，TLR4和NF-κB mRNA表达也呈一致性增加。提示高血糖诱导miR-155表达，促进TLR4/NF-κB炎症通路激活，调节炎性因子和趋化因子分泌，进而介导血管内皮功能障碍，参与动脉粥样硬化形成。因此，下调miR-155水平可能与动脉粥样硬化改善和心血管事件低发生率相关。Kishore等研究显示，骨髓干细胞移植通过旁分泌肝细胞生长因子，可以下调miR-155表达，从而改善心脏纤维化和心功能[8]。国内也有研究显示，下调miRNA-155表达水平可显著减少糖尿病脑缺血大鼠脑梗死体积[9]。

近年来，新型降糖药物利拉鲁肽除降血糖外，在改善血管内皮功能障碍、抗动脉粥样硬化中的作用受到广泛关注，但其具体作用机制尚不清楚。国外有研究显示，利拉鲁肽通过抑制单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、TNF-α和IL-1β的分泌，发挥抗炎作用，减轻主动脉粥样硬化病变程度[10]。另一项实验使用不同浓度利拉鲁肽干预oxLDL诱导的泡沫细胞结果显示，利拉鲁肽处理的泡沫细胞TG和TC含量显著降低，泡沫细胞胞浆脂质滴明显减少，此外，利拉鲁肽治疗后泡沫细胞表现出氧化应激受损[11]。一项临床研究显示，对2型糖尿病合并肥胖的患者在二甲双胍(1～2g/d)和磺脲类药物(格列美脲)治疗基础上给予利拉鲁肽1.2mg/d，6周后检测到单个核细胞中TNF-α、IκB和TLR4 mRNA表达较对照组下降，沉默信息调节因子-1(SIRT1)基因表达增加，抑制NF-κB促炎效应，从而改善代谢状况[12]。本研究显示，利拉鲁肽中剂量干预组miR-155水平下调，TLR4和NF-κB mRNA表达均减低，在利拉鲁肽大剂量组对三者的降低更为显著，提示利拉鲁肽可呈剂量依赖性改善糖尿病动脉粥样硬化大鼠，下调miR-155表达，抑制TLR4/NF-κB炎症通路，进而减低下游炎症因子的表达，发挥血管保护作用，成为糖尿病动脉粥样硬化疾病新的治疗靶点。另有研究也显示，利拉鲁肽可呈剂量依赖性抑制胰岛素抵抗大鼠肾脏NF-κB、TNF-α和IL-6的表达,利拉鲁肽大剂量组[200μg/(kg·d)]比低剂量组[100μg /(κg·d)]降低更明显，可能参与肾功能改善[13]。

综上所述，给予糖尿病动脉粥样硬化大鼠补充利拉鲁肽，不仅降低了血糖、血脂，还降低了动脉粥样硬化组织miR-155水平及TLR4/NF-κB炎症通路的表达，呈现剂量依赖性的抗炎作用，从而发挥血管保护，但其具体机制尚需进一步研究。