MTHFRC677T基因多态性、叶酸及同型半胱氨酸水平与原发性肝细胞癌相关性分析*

孟凌云 陈 静 山东省泰安市中心医院检验科 7000； 山东第一医科大学基础医学院

原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)为全球高发恶性肿瘤，位于致死性疾病前列[1]。与其相关的研究一直是医学研究的热点，肝脏是机体主要的代谢场所，其产生的亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylene tetraphydrofolate reductase，MTHFR)是叶酸代谢的关键酶，不可逆的催化5,10-亚甲基四氢叶酸(5,10-MTHF)还原为5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)，后者可以进一步进入甲基循环通路，通过同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)的重新甲基化过程间接为DNA甲基化和蛋白质甲基化提供甲基，并且使血液中的同型半胱氨酸维持在一个较低的水平。并且已有研究证实HCY水平与基因多态性是具有相关性的[2]。在与其相关的众多基因中，MTHFR C677T的突变是最常见的，会使得亚甲基四氢叶酸还原酶活性降低，进而导致Hcy升高[3]。虽然之前有对HCC患者的叶酸、Hcy水平的相关研究，但是并没有明确说明其与基因突变之间的关系，并且有研究发现MTHFR基因多态性与HCC的相关性不尽相同[4-5]，推测其会受到地域、民族等因素的影响。为了进一步明确叶酸、Hcy及MTHFR C677T基因多态性与HCC患者的相关性，本文对HCC患者与上述三者的相关性进行研究，旨在为临床诊断及预防HCC提供理论性指导。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2019年10月—2020年10月于泰安市中心医院新诊断为原发性肝细胞癌(病理诊断明确)的患者(未行化疗、放疗及其他药物治疗)85例为HCC组，选取同一时期该医院查体中心的健康人员85例为健康对照组。采样前均告知患者家属检查方法及流程，并征得同意签署知情同意书，同时此项研究已取得医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 血清叶酸及Hcy水平检测：两组受试者均于清晨空腹采取肘静脉血样，经高速离心后取血清保存，以备后续检测叶酸及Hcy水平并进行基因组DNA的提取。血清叶酸采用德国罗氏601系列全自动免疫发光分析仪；Hcy检测采用德国罗氏8000全自动生化分析仪。所有试剂为进口配套试剂，质控合格后进行检测。

1.2.2 MTHFR C677T基因多态性检测：收集受试者的外周血，提取样本中DNA。采用 Taqman-MGB 方法测定各基因位点的SNP分型，相关仪器和试剂均购买自美国AB公司。对MTHFR C667T位点进行荧光定量PCR检测。每个PCR反应体系共计为10μl，其中加入3.5μl去离子水，1μl浓度为20ng/μl的DNA模板，0.5μl 的20×Taqman-MGB探针，5μl 的2×Taqman Universal Master Mix。反应条件:95℃预变性10min，92℃变性15s，60℃延伸1min，20个循环；89℃变性15s，60℃延伸90s，30个循环。反应结束后，把各反应孔放置于VIIA7DX 型高通量荧光定量 PCR 仪上，分别读取各反应孔的终点荧光，然后利用分析软件检测位点中的基因分型。

2 结果

2.1 两组叶酸及Hcy水平比较 HCC组叶酸水平低于健康对照组，Hcy水平显著高于健康对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 两组血清叶酸及Hcy水平比较

2.2 两组MTHFR C677T基因多态性及等位基因频率比较 HCC组TT型分布率显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；HCC组T基因频率升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 两组MTHFRC677T基因多态性及等位基因频率比较(n)

2.3 MTHFR C677T不同基因型叶酸及Hcy水平比较 TT型Hcy水平明显高于CT及CC型，差异具有统计学意义(P<0.05)，而三种基因型间叶酸水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 不同基因型叶酸及Hcy水平比较

3 讨论

原发性肝细胞癌的发病率和死亡率居于癌症前列，并且我国的原发性肝细胞癌患者占全球总数的一半以上[6]，近年来有很多有关其致病因素的研究，主要集中在生活环境、饮食习惯及病毒感染等方面[7]，而最新的研究显示叶酸水平的降低与肝癌发生进展相关[8].叶酸的代谢是一个复杂的过程，已经有研究证实其与基因MTHFR C677T的多态性是相关的[9]，而且其代谢过程会影响HCY的水平[10]。但是并没有研究探讨过其与原发性肝细胞癌的直接相关性。

国人由于喜食熟食及吸烟饮酒等不良习惯原因，容易导致缺乏叶酸、维生素B6和B12[11]，而叶酸水平降低则会导致体内同型半胱氨酸的蓄积。Hcy是体内蛋氨酸(SAM)循环的中间产物，而SAM是甲基重要供体，影响DNA甲基化和修复。Hcy蓄积，影响DNA的稳定性，异常甲基化，造成基因序列的改变，包括原癌基因激活或者抑癌基因的失活，增加恶性肿瘤的患病风险[12]。本研究结果显示，HCC组叶酸水平明显低于健康对照组，而Hcy水平高于健康对照组，差异具有统计学意义，与既往研究结果一致。说明对于原发性肝细胞癌患者来说，重视叶酸摄入水平，对于肝癌的预防至关重要，同时，Hcy水平的升高作为患者罹患肝癌的重要指标，应值得重视。本次研究中，MTHFR C677T基因在HCC组中TT型分布率显著升高，T基因频率升高，MTHFR基因的C677T位点突变最为常见，会降低亚甲基四氢叶酸还原酶的活性和热稳定性，继而影响体内叶酸代谢，使 Hcy甲基化过程受阻导致同型半胱氨酸在血浆中水平升高。该酶最常见的基因突变位点是rs1801133的C到T的突变，即TT突变型较CC野生型使得酶的活性显著下降，引起叶酸合成减少，而叶酸的缺乏导致基因不稳定性增加和甲基化障碍，与肿瘤的发生有相关性。另外，本研究对MTHFR C677T的不同基因型的叶酸及Hcy水平进行了具体研究，通过与其他基因型比较发现，TT型的Hcy水平显著升高，然而不同基因型间叶酸水平比较差异无统计学意义，这与原永明等人[13]的研究结论相似。既然原发性肝细胞癌患者的MTHFR基因型及叶酸和Hcy水平会存在异常，那么检测具有原发性肝细胞癌倾向人群的MTHFR基因型及叶酸和Hcy水平，对于及早预防肝癌是有帮助的。目前肝癌的治疗方式，不仅局限于肝脏移植，靶向治疗[14]及基因治疗[15]也成为HCC治疗的新方向。该研究通过基因型的检测只能间接地反映酶的相对活性，并没有对实际的酶活性进行测定，因此通过分析该酶血清含量及基因型反映的相对酶活性与 HCY 水平的关联性，解释该酶与 HCY 水平的关系可能存在一定的局限性。

综上所述，原发性肝细胞癌倾向人群做MTHFR基因型及叶酸和Hcy水平检测，对于及早预防肝癌有一定的帮助。但本研究属于医院内病例对照研究，样本偏少，可能存在选择偏倚的情况，因此后续还需要进行较大规模的普查研究，以进一步证实研究结论及进行更深入的探讨。