雷公藤内生真菌对Fusarium nisikadoi NS-1雷公藤甲素合成的影响

李国庆, 宋 萍, 洪 伟,2, 吴承祯, 封 磊

(1.福建农林大学林学院，福建 福州 350002；2.福建省高校森林生态系统过程与经营重点实验室，福建 福州 350002；3.武夷学院，福建 武夷山 354300；4.福建农林大学资源与环境学院，福建 福州 350002)

雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f.)属卫矛科雷公藤属，又叫黄藤、黄腊藤等，主产于福建、江西、浙江、安徽、湖南、广东等地，是中国传统的药用藤本植物.雷公藤甲素(Triptolide)是雷公藤的主要生物活性成分之一，为一种环氧二萜单体，除具有明显的抗白血病及其它多种肿瘤作用外，还具有免疫抑制和抗炎作用，对多种促炎细胞因子和介质以及内皮细胞粘附分子的表达具有抑制作用，并具有诱导自身或其它细胞凋亡的能力[1].然而，雷公藤甲素在雷公藤体内的含量极低且人工合成困难，雷公藤野生资源又日益遭到破坏，其产量远远不能满足市场需求，因此急需寻找一条有效途径来替代雷公藤植物资源，实现雷公藤甲素的高效生产.

植物内生真菌(Endophytic fungi)是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部，不会引起宿主明显病症或者对宿主造成明显伤害的真菌[2].内生真菌与宿主植物协同进化，易携带宿主的某些基因，可能合成与宿主相同或相似的具有生物活性的次生代谢产物[3].自1993年Stierle et al[4]首次从短叶红豆杉(Taxusbrevifolia)的韧皮部分离出1株产抗癌物质紫杉醇的内生真菌以来，国内外学者已相继从南方红豆杉、罗汉松、东北红豆杉、长春花、雷公藤、美登木、桃儿七、南方山荷叶、川八角莲等植物中分离出能够生成紫杉醇、长春新碱、细胞松弛素、球毛壳甲素、鬼臼毒素等生物活性物质的内生真菌[5].目前，植物内生真菌的次级代谢产物成为了天然化合物的重要来源，而利用微生物发酵法生产生物活性物质也为解决植物药源短缺问题提供了新方法.

自然条件下的微生物常以混合菌落的形式存在，有着复杂的物理或化学信号交流，彼此间有着各种各样的相互作用，如协同代谢、诱导代谢、竞争抑制等[6].但微生物在实验室单独培养时往往缺少了这些互作机制，使得很多编码天然产物的基因难以表达或表达率过低[7].其中，两种或多种微生物的共培养可以模拟自然状态下微生物之间的互作机制，是一种能够激活沉默基因产生新的次生代谢产物[8]或提高现有次生代谢产物积累的有效方法[9].如Nonaka et al[10]通过将真菌FusariumsolaniFKI-6853和Talaromycessp.FKA-65共培养，在菌液中提取到了一种全新的具有抗流感病毒活性的青霉酸衍生物Coculnol；以同步接种或顺序接种的方式将TrichodermaasperellumGDFS1009与Bacillusamyloliquefaciens1841进行共培养，结果发现两种微生物的代谢产物和重要基因(孢子形成、次生代谢产物、真菌寄生酶和抗氧化物)的表达均得到上调，并且代谢物的变化改善了其生物控制潜力和植物促生活性[11].植物内生菌共栖于植物体内环境，彼此间存在着直接或间接的相互作用，能够产生活性物质的内生菌及其代谢能力必然受到其它内生菌的影响.因此，利用内生菌发酵生产目标活性物质时，有必要将产生活性物质的内生菌与其它内生菌进行共培养，以模拟自然条件下内生菌共存的环境，强化目标化合物的生产.

利用诱导子提升次生代谢物产量是植物悬浮细胞培养中常用的方法，而植物内生菌常被作为生物诱导子应用于植物细胞培养体系内，可以促使植物细胞产生防御反应，进而触发植物次生活性物质的合成.内生菌诱导子用于调节微生物次生代谢的研究较少，仅见于竹子内生真菌Trametessp.GZUIFR-TT1诱导子促进了竹黄(Shiraiabambusicola)的竹红细菌素生产，试验值最高约为对照的7.9倍[12].本试验从雷公藤中分离出1株具有雷公藤甲素合成能力的内生真菌NS-1，通过NS-1与其它内生真菌共培养及诱导子的添加，研究内生真菌及其诱导子对NS-1合成雷公藤甲素的影响，以探究内生真菌间的交互作用对内生真菌次生代谢的影响，为内生真菌发酵生产雷公藤甲素提供依据.

1 材料与方法

1.1 供试内生真菌

雷公藤内生真菌共19株，筛选自福建省森林生态系统过程与经营重点实验室苗圃的雷公藤植株，种源地为福建泰宁.

1.2 产雷公藤甲素内生真菌的筛选

将保藏于-80 ℃甘油管中的雷公藤内生真菌接种到马铃薯葡萄糖固体培养基中进行活化，用直径为6 mm的打孔器在每个经活化的菌落边缘打取3块等面积的菌块，分别接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，于28 ℃，120 r·min-1条件下震荡培养7 d，过滤培养物得到培养液，以雷公藤甲素标准品(含量≥99.5%，福建省医学科学研究所提供)溶液作对照，用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)对各菌株的代谢产物进行检测.

液相色谱条件：色谱柱Ultimate XB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；波长218 nm；柱温20 ℃；流动相为水/甲醇(体积分数)50/50；流速1.0 mL·min-1；进样量5 μL.

质谱条件：电喷雾离子源；正离子扫描；毛细管电压1.00 kV，源温度120 ℃，脱溶剂气温度350 ℃，脱溶剂气流量720 L·h-1，碰撞室压力40 psi.

1.3 雷公藤内生真菌的鉴定

采用rDNA ITS序列分析对雷公藤内生真菌进行鉴定.DNA鉴定提取试剂盒分别为TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.D304)、TaKaRa Fungi Identification PCR Kit(Code No.D317)、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0(Code No.D823A)和DL 2000 DNA Marker.引物为Seq Reverse Primer：5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′；Seq Fprward Primer：5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′.PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性0.5 min，55 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸1 min，共30个循环；最后72 ℃延伸5 min.测序由大连宝生物有限公司完成.测序结果通过DNAstar软件进行分析，并在GenBank核酸序列数据库中进行同源序列比对，利用MEGA 7软件进行分子系统发育分析.

1.4 内生真菌悬浮共培养

将雷公藤内生真菌接种于马铃薯葡萄糖固体培养基中，于28 ℃恒温培养3 d，利用直径6 mm的打孔器在每个菌落边缘打取3块等面积的菌块，将产雷公藤甲素菌株NS-1分别与其它内生菌株两两混合接种到装有40 mL马铃薯葡萄糖液体培养基的100 mL三角瓶中，28 ℃，120 r·min-1摇床中震荡培养.以单独接种和培养NS-1作为对照(CK)，每个处理重复3次.

1.5 内生真菌诱导子的制备

将内生真菌在马铃薯葡萄糖液体培养基中培养至指数阶段，过滤获取菌丝体及培养液，称取50 g湿菌体，用无菌去离子水冲洗3次后，匀浆加入100 mL无菌去离子水，用 10%氯乙酸将pH调整为4.0，沸水浴1 h，减压抽滤，取滤液，用无菌去离子水定容至100 mL，加入NaOH将pH调整为7.0，即为菌丝体提取物诱导子；将过滤所得的培养液于60 ℃下旋转蒸发浓缩至原体积的1/3，即得到发酵液诱导子.两种诱导子的浓度以硫酸—苯酚法测得的总糖含量进行计算，并于4 ℃冷藏备用，使用前用微孔滤膜(0.22 μm)过滤除菌.

1.6 诱导子的添加

向马铃薯葡萄糖液体培养基添加两种诱导子，以诱导子的糖浓度来确定其添加量，其终浓度分别设置为20、40、60、80 μg·mL-1，添加同等体积的无菌水作为对照(CK).取各处理的培养基40 mL装入100 mL三角瓶中，接入等面积的NS-1菌块，28 ℃，120 r·min-1摇床上培养9 d.每隔24 h取样1次，测定NS-1的生物量、培养液pH值、培养液中总糖含量及胞内、胞外雷公藤甲素含量.其中pH值用pH计测定；总糖含量用硫酸—苯酚法测定；将菌丝体置于恒温烘箱中，60 ℃烘干至恒重，用电子天平称其生物量.每个处理重复3次.

1.7 雷公藤甲素的测定

取5 mL内生真菌培养液于离心管中，经0.22 μm微孔滤头过滤所得液体为待测液，微量注射器吸取5 μL，采用高效液相色谱(HPLC)法测定胞外雷公藤甲素含量，每个样品重复3次.将内生真菌菌丝体于60 ℃烘干至恒重，称取0.1 g干菌体，研磨后导入10 mL离心管，用甲醇浸提24 h并定容至3 mL，经微孔滤头(0.22 μm)过滤所得液体即为待测液，微量注射器吸取5 μL，应用HPLC测定胞内雷公藤甲素含量，色谱条件同1.2.每个样品重复3次.

2 结果与分析

2.1 产雷公藤甲素菌株NS-1的筛选

利用LC-MS/MS对不同雷公藤内生真菌的代谢产物进行分析(图1)，筛选具有雷公藤甲素合成能力的内生真菌NS-1.

a.雷公藤甲素标准品一级质谱图；b.雷公藤甲素标准品二级质谱图；c.内生真菌NS-1代谢物一级质谱图；d.内生真菌NS-1代谢物二级质谱图.

雷公藤甲素的分子式为C20H24O6，相对分子质量360.4，利用LC-MS检测雷公藤甲素标准品溶液和NS-1培养液，正离子模式下得到图1a和1c中相同的[M+H]+峰和[M+Na]+峰.通过对图1c中的[M+H]+峰进行LC-MS/MS测定，得到一系列片段峰(图1d)，将其与雷公藤甲素标准品[M+H]+峰的LC-MS/MS图谱(图1b)进行比对，发现二者主要片段峰相似，判定内生真菌NS-1具有合成雷公藤甲素的能力.

2.2 内生真菌对NS-1雷公藤甲素合成的影响

将NS-1与其它非产雷公藤甲素内生真菌进行悬浮共培养，并对不同培养组合中雷公藤甲素的最高产量进行比较(图2)，有5对组合(NS-1+NS-5、NS-1+NS-8、NS-1+NS-14、NS-1+NS-18、NS-1+NS-29)的雷公藤甲素积累量均显著大于对照(P<0.05)，说明非产雷公藤甲素内生真菌(NS-5、NS-8、NS-14、NS-18、NS-29)对NS-1雷公藤甲素的合成具有不同程度的促进作用，其中NS-8的促进作用最强.NS-1+NS-8悬浮共培养的雷公藤甲素积累量最高(约0.076 μg·mL-1)，是对照的1.6倍.

*表示显著高于对照,P<0.05.

2.3 内生真菌分子生物学鉴定

对内生真菌NS-1和NS-8的rDNA ITS序列进行基因测序，将测序数据上传GenBank，分别获取登录号JQ839269和KF835616.利用Blast程序对两株内生菌的序列进行比对分析，结果表明，NS-1与镰刀菌属的Fusariumnisikadoi(登录号为GU205429)具有较好的相似度，其同源性达到99%，而NS-8与青霉菌属的Penicilliumsteckii(登录号为HM469415)具有较高的相似度，同源性为100%.另外，通过邻接法构建NS-1和NS-8的系统发育树(图3)，NS-1与NS-8分别与Fusarium属及Penicillium属菌株处于同一分支.

图3 雷公藤内生真菌NS-1与NS-8的系统发育树

2.4 内生真菌诱导子对NS-1相关生长代谢指标的影响

分别将内生真菌NS-8的菌丝体提取物与发酵液诱导子添加到NS-1培养体系中，测试其相关生长代谢指标的变化情况.在加入发酵液诱导子后，试验组与对照组pH值的变化基本呈现相近的增长趋势，但试验组pH的变化速率大于对照组，在开始培养的1～4 d，试验组pH值均大于对照组，并且在第4天试验组与对照组的pH值均有不同程度下降，而在培养的4～9 d，虽然对照组与试验组的pH值都略有起伏但整体趋于稳定(图4a).发酵液诱导子的加入对NS-1菌株的糖消耗具有明显的促进作用，所有试验组的糖消耗速率均高于对照组，且随着诱导子浓度的增加而升高，说明发酵液诱导子促进了NS-1的生长代谢(图4b).发酵液诱导子在诱导初始期和诱导后期对NS-1生物量显示出促进作用，但在诱导前期，试验组生物量则略低于对照组(图4c).添加NS-8菌丝体提取物诱导子后，试验组pH值的整体变化趋势与对照组类似，但时间上明显滞后，各试验组pH值在第6天达到最低值，随后快速升高，后期与对照组趋同(图4d).添加菌丝体提取物后，试验组与对照组的NS-1糖消耗曲线均呈明显的下降趋势，但两者间的糖消耗速率差异并不显著(图4e).添加NS-8菌丝体提取物对NS-1的生长呈现出一定的抑制作用，试验组的NS-1生物量小于对照组(图4f).

a，b，c为NS-8发酵液诱导子；d，e，f为NS-8菌丝体提取物诱导子.

2.5 诱导子对NS-1胞外雷公藤甲素的影响

菌株NS-8的两种诱导子对NS-1胞外雷公藤甲素的生成有明显的差异(图5).其中NS-8发酵液诱导子对胞外雷公藤甲素的积累具有明显的促进作用，培养4 d后试验组的胞外雷公藤甲素含量显著高于对照组，其促进作用随着诱导子浓度的升高而有所下降，当添加20 μg·mL-1的NS-8发酵液诱导子，NS-1胞外雷公藤甲素含量在培养至7 d时达到最大值，为对照组的4.2倍.向NS-1培养液中添加不同浓度NS-8菌丝体提取物诱导子时，胞外雷公藤甲素的积累量均显著低于对照组，说明该类型诱导子对NS-1胞外雷公藤甲素的生成具有明显的抑制效应.

a.NS-8发酵液诱导子；b.NS-8菌丝体提取物诱导子.

2.6 诱导子对NS-1胞内雷公藤甲素的影响

与对照组相比，NS-8发酵液诱导子的添加对NS-1胞内雷公藤甲素积累的促进作用不明显(图6a)，仅在培养至3 d时，试验组雷公藤甲素含量显著高于对照组.菌丝体提取物诱导子在NS-1培养前期促进了其胞内雷公藤甲素的积累，随着添加浓度的升高，其促进作用逐渐减弱(图6b).NS-1培养中期，两种诱导子的促进作用迅速下降，甚至出现抑制作用.培养后期，试验组与对照组胞内雷公藤甲素含量均迅速下降，两者无显著差异.无论是NS-8培养液诱导体系还是菌丝体提取物诱导体系，诱导子添加浓度为20 μg·mL-1、培养时间为6 d时，NS-1胞内雷公藤甲素含量最高，分别为对照的1.4和1.2倍.

a.NS-8发酵液诱导子；b.NS-8菌丝体提取物诱导子.

3 讨论与结论

雷公藤甲素是从雷公藤中提取出的环氧二萜类内酯次生代谢产物，是其主要活性成分，拥有较强的抗肿瘤活性，并具有抗炎及免疫抑制等多种药理作用，但其市场供应一直受限于雷公藤资源的匮乏.内生真菌是植物体内所蕴藏的一类重要微生物资源，不仅对植物生长发育具有重要的调控作用，其次生代谢产物也是天然化合物的巨大资源宝库.本试验通过对前期分离的雷公藤内生真菌代谢产物进行分析鉴定，筛选出1株具有雷公藤甲素合成能力的内生真菌NS-1，鉴定为Fusariumnisikadoi.近年来，越来越多的药用植物内生真菌被证实能够产生与宿主植物相同或相似的活性物质，这可能是在漫长的共生进化过程中，宿主植物将其遗传物质或信息传递给内生真菌，实现横向基因转移，使得两者具有相似的代谢途径及合成酶类，进而生成相同或相似的活性成分[13].内生真菌NS-1的发现为雷公藤甲素或其类似物的生产提供了新途径，即可利用内生真菌NS-1发酵生产雷公藤甲素或其类似物.

植物体内存在着多种共生菌，若将其中的菌株进行分离并单独培养，会减少与其他内生菌的相互作用，使某些功能发生变化.当内生菌混合共培养时，彼此间以不同方式相互作用，包括共生、竞争、协同代谢或通过分泌到胞外代谢物中的信号分子、毒素、抗生素等产生相互作用，这些作用可能导致内生菌代谢活性的变化，诱导产生新的化合物或提高已有次生代谢产物的产量[14].本试验通过建立雷公藤内生真菌NS-1与其它内生真菌的共培养体系，模拟内生真菌在植物中与其它内生真菌共存的环境，通过内生真菌之间的相互作用强化雷公藤甲素合成途径的表达，从而提高其产量.研究表明，有5株雷公藤内生真菌对NS-1的雷公藤甲素合成具有促进作用，其中青霉菌属内生真菌NS-8的促进作用最明显，是对照的1.6倍.有研究表明[15]，产紫杉醇的红豆杉内生真菌ParaconiothyriumSSM001与Alternariasp.共培养时，可使紫杉醇产量提高3倍，而与Alternariasp.、Phomopsissp.共培养时，紫杉醇产量提高8倍.因此，两种或多种内生真菌共培养是提高目标化合物产量的有效方法.

内生真菌诱导子能够快速、高度专一和选择性地诱导细胞内特定基因的表达，进而活化特定次生代谢途径，调控次生代谢物的生物合成，促进活性成分的积累[16].本试验将对NS-1雷公藤甲素合成具有明显促进作用的内生真菌NS-8制备成发酵液诱导子和菌丝体提取物诱导子，添加到NS-1培养体系中，分析NS-8对NS-1雷公藤甲素合成的诱导作用.结果表明，添加NS-8发酵液诱导子后，在培养前期NS-1的糖消耗速率升高，生长代谢增强，而细胞的快速生长则导致大量代谢物质释放到培养液中，培养液pH值有所升高，但此阶段胞内、胞外雷公藤甲素的积累相较于对照组无显著差异；在培养后期，培养液pH值、NS-1糖消耗和生物量的变化趋小，略高于对照组，但此时NS-1的雷公藤甲素生成情况有显著变化，特别是胞外雷公藤甲素的积累，最高为对照组的4.2倍.由此可见，NS-8可通过其代谢产物促进NS-1雷公藤甲素的合成.其它微生物释放的化学信号可引起多种防御反应，包括菌丝形态的改变、各种次生代谢产物的合成和胞外酶的产生，这些被激活的防御代谢产物可作为化学线索，触发一系列转录激活[17].NS-8发酵液诱导子可能引起NS-1细胞的防御性应答反应，使雷公藤甲素等次生代谢产物合成提高.然而，当次生代谢产物积累过多，细胞本身为避免毒害会产生次生代谢物质，此时一些能够分解次生代谢物质的酶被激活，从而使次生代谢产物产量在迅速升高后又在短期内迅速下降[18].NS-8菌丝体提取物诱导子的添加对NS-1生长呈现一定程度的抑制作用，其生物量及糖消耗速率均低于对照组，胞外雷公藤甲素含量也显著低于对照组，胞内雷公藤甲素的合成量也未显示显著升高.因此，NS-1的雷公藤甲素合成与其生长状况相关联，NS-8菌丝体中可能含有能够抑制NS-1初级代谢和次级代谢的成分，使细胞生长受到限制，次级代谢前体物积累减少，导致雷公藤甲素合成降低.

综上，本试验从雷公藤体内分离出1株能够产雷公藤甲素的内生真菌FusariumnisikadoiNS-1，与其它内生真菌共培养时，青霉菌属NS-8对其雷公藤甲素合成具有显著的促进作用.NS-8菌丝体提取物诱导子对NS-1生长和雷公藤甲素积累无显著的促进作用；NS-8发酵液诱导子能够促进NS-1生长，提高其胞外雷公藤甲素的积累，最高可达对照的4.2倍，具有较好的应用前景.