樟芝适宜的液体发酵培养基配方研究

王丽星　黄志伟　郑亚凤

摘要：研究了珍贵药用菌——樟芝（Antrodia camphorata）液体发酵适宜的碳源、氮源、碳氮比及其所需的矿质元素、微量元素、维生素。结果表明：樟芝菌丝生长的最适无机氮源为酒石酸铵；最适有机氮源为麸皮；最适天然碳源为米粉，且以天然多糖类物质（木薯粉除外）为碳源处理的菌丝产量明显高于单糖、双糖、化学制剂多糖处理，而葡萄糖是仅次于天然多糖类物质的碳源；菌丝生长适宜的碳氮比为（20～50） ∶ 1；K、P、Mg、S、Na、Ca均为菌丝生长必需的矿质元素；微量元素Fe、B、Zn、Mn、Mo、Cu、Co均对樟芝菌丝生长有一定抑制作用，其中Fe、B元素的抑制作用最显著；添加维生素对菌丝生长无显著影响。

关键词：樟芝；菌丝体；液体发酵；培养基配方

中图分类号： S188+.4 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0236-03

樟芝（Antrodia camphorata）属于多孔菌科、薄孔菌属[1]，别称牛樟菇、牛樟芝、樟内菇、红樟菰等，为中国台湾特有的珍贵药用真菌[2]。樟芝仅寄生在台湾特有树种牛樟（Cinnamomum comphora）的树干上[3]，具有抗肿瘤、增加免疫力、抗菌、抗病毒、抗过敏、抗高血压、降血糖、降胆固醇、抑制血小板凝集及保护肝脏等生理功能[4]。目前野生樟芝数量很少，而且尚未能进行其子实体的人工栽培，所以采用液体发酵培养樟芝的菌丝体是最环保的樟芝获取途径，并且菌丝体的效果接近子实体[5]。刘华等研究了樟芝液体发酵培养条件，采用的培养基配方为40 g/L葡萄糖、6 g/L豆饼粉、1 g/L K2HPO4、100 mg/L 维生素B1，pH值自然，接种量为20%，装液量为100 mL/250 mL三角瓶，转速100 r/min，26 ℃恒温培养6 d后，胞内的三萜产量达 152.5 mg/L[6]。黄大斌等在电子显微镜下观察了樟芝的菌丝体、子实体、分生孢子，并在琼脂培养基上研究了不同碳源、氮源对樟芝菌丝生长的影响，结果发现樟芝菌丝生长最适温度为28 ℃，木屑培养基的最适含水量为58.5%，最适碳源为2%葡萄糖，最适氮源为0.2%柠檬酸铵[7]。黄志伟等对樟芝菌丝体的固体培养特性进行了研究，结果表明以杂木屑、麦皮（或稻草粉）为主料的培养基均可培养出生长良好的樟芝菌丝，菌丝生长适宜的PDA 培养基pH 值为4～8，在木屑培养基中添加3%～5%的过磷酸钙可促进菌丝生长，光照和黑暗条件下菌丝的生长速度没有显著差异，但在黑暗条件下菌丝长势较好，分生孢子较多[8]。宋爱荣对樟芝液体培养的碳源、氮源分别进行了研究，结果表明碳源以麦芽糖利用效果最佳，有机氮比无机氮的利用效果更好，其中以酵母膏最佳[9-10]。陈娟等以樟芝菌丝生物量、三萜、多糖为响应指标，利用Plackett-Burman法筛选樟芝液态发酵培养基碳源、氮源，结果显示，最有利于提高樟芝菌丝生物量的碳源、氮源为葡萄糖、可溶性淀粉、酵母粉，最有利于提高樟芝多糖含量的碳源、氮源为可溶性淀粉、麸皮，而最有利于提高樟芝三萜含量的碳源为麦芽糖[11]。凌庆枝等研究表明，樟芝对不同无机盐离子需求不同，对钾盐需求量大，对钠盐、铁盐、镁盐、铜盐需求量少[12]。本研究探讨了适宜樟芝液体发酵的碳源、氮源、碳氮比及其所需的矿质元素和微量元素等，以期为深入研究樟芝的液体发酵工程技术奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 樟芝菌株Ac-A，由福建农林大学菌物研究中心提供。

1.1.2 供试培养基配方

1.1.2.1 研究不同氮源对樟芝菌丝生长影响的培养基配方 基础培养基配方：3%葡萄糖、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O、5 mg/L 维生素B1，pH值自然。添加的无机氮种类为硫酸铵、氯化铵、磷酸氢二铵、酒石酸铵、硝酸钾、硝酸钠、硝酸钙、硝酸铵；有机氮种类为蛋白胨、大豆粉、麸皮、玉米粉。氮源添加量为0.032 g N/100 mL无机氮、0.2%蛋白胨、5%天然有机氮。

1.1.2.2 研究不同碳源对樟芝菌丝生长影响的培养基配方 基础培养基配方：0.032%（以氮含量计算）酒石酸铵、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O、5 mg/L维生素B1、pH值自然。添加的碳源种类为葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、可溶性淀粉、微晶纤维素、玉米粉、面粉、米粉、甘薯粉、木薯粉。碳源添加量为2%。

1.1.2.3 研究不同碳氮比对樟芝菌丝生长影响的培养基配方 基础培养基配方：2%葡萄糖、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O、5 mg/L 维生素B1，pH值自然。分别在基础培养基中添加不同质量的酒石酸铵以调节培养基的C/N。

1.1.2.4 研究不同矿质元素对樟芝菌丝生长影响的培养基配方 基础培养基配方：2%葡萄糖、0.211%酒石酸铵、5 mg/L 维生素B1，pH值自然。按表1在基础培养基中添加各种试剂，配制出6种缺素培养基和1种对照培养基。

1.1.2.5 研究不同微量元素对樟芝菌丝生长影响的培养基配方 基础培养基配方：2%葡萄糖、0.211%酒石酸铵、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O，pH值自然，用重蒸馏水配制1 L基础培养基后，加入15 g CaCO3，在121 ℃下灭菌20 min，冷却后过滤除去微量元素，随后加入5 mg 维生素B1，并按表2添加各种微量元素。

1.1.2.6 研究不同维生素对樟芝菌丝生长影响的培养基配方 基础培养基配方：2%葡萄糖、0.211%酒石酸铵、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O，pH值自然。添加的维生素种类为生物素、核黄素、硫胺素、尼古丁酸、叶酸、抗坏血酸，对照不添加任何维生素。维生素添加量为50 μg/L。

1.2 方法

1.2.1 不同氮源对樟芝菌丝生长的影响 将培养基分装于250 mL三角瓶中（100 mL/瓶），每个处理4瓶，在121 ℃下灭菌30 min。接种时，先将樟芝斜面菌种放入盛有无菌水的三角瓶中，用分散器搅拌匀浆，使之成为均匀的菌液。然后用移液枪吸取菌液接种于各瓶培养基中（1 mL菌液/100 mL），接种后置于摇床上振荡培养（26 ℃、120 r/min ）20 d。用纱布和40目土样筛过滤樟芝菌丝，分别盛入已于105 ℃下烘至恒质量的坩埚，再将坩埚置于105 ℃烘箱中烘至恒质量后，测定菌丝干质量。然后用SAS 软件 对数据进行方差分析与显著性测验。

1.2.2 不同碳源、矿质元素、微量元素、维生素对樟芝菌丝生长的影响 参照“1.2.1”节的方法进行培养基的分装、灭菌、接种、培养、测定菌丝干质量等。

1.2.3 不同碳氮比对樟芝菌丝生长的影响 设置8个C/N，即 5 ∶ 1、10 ∶ 1、15 ∶ 1、20 ∶ 1、30 ∶ 1、50 ∶ 1、75 ∶ 1、100 ∶ 1，在基础培养基中添加酒石酸铵调节培养基的C/N，酒石酸铵添加量依次为16.03、6.35、3.96、2.88、1.86、1.09、0.72、0.54 g/L。然后参照“1.2.1”节的方法进行培养基的分装、灭菌、接种、培养、测定菌丝干质量等。

2 结果与分析

2.1 不同氮源对樟芝菌丝生长的影响

2.1.1 无机氮对樟芝菌丝生长的影响 由图1可见，不同氮源处理下菌丝产量差异较大，说明樟芝对氮源种类的要求较为严格。不同氮源处理下樟芝菌丝产量高低排序为蛋白胨（有机氮）>铵态氮>硝态氮，差异明显。以硝酸钾、硝酸钠、硝酸钙为氮源时，菌丝产量与对照无明显差异，说明樟芝不能利用硝态氮。硝酸铵既可以提供硝态氮，也可提供铵态氮，其菌丝产量比硝态氮高，但比铵态氮低，说明NO-3可能抑制樟芝菌丝生长。樟芝菌丝生长最适宜的无机氮源为酒石酸铵。

2.1.2 有机氮对樟芝菌丝生长的影响 由图2可见，不同有机氮源处理下樟芝菌丝产量高低顺序为麸皮>大豆粉>玉米粉>蛋白胨>无氮对照，差异明显。以麦皮为氮源时，其菌丝产量是蛋白胨处理的5倍，是最适于樟芝菌丝生长的氮源。

2.2 不同碳源对樟芝菌丝生长的影响

从图3可以看出，以天然多糖类物质为碳源处理的菌丝产量明显高于双糖、单糖。以米粉为碳源处理的菌丝产量最大，与其他碳源处理差异明显。本研究使用了5种天然物质和2种化学制剂多糖，除木薯粉外，以天然物质为碳源处理的菌丝产量明显高于以化学制剂多糖（可溶性淀粉、微晶纤维素）为碳源的处理。将天然物质作为碳源，水解后可提供多

种糖类供菌丝吸收利用，并且它还含有少量氮素营养或一些生长促进因子，可促进菌丝生长。以麦芽糖、蔗糖为碳源处理的菌丝产量较低。葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露醇中，唯有葡萄糖适于樟芝菌丝生长。

2.3 不同碳氮比对樟芝菌丝生长的影响

基于上述碳源、氮源的筛选结果，选用适于樟芝菌丝生长的碳源（葡萄糖）和无机氮源（酒石酸铵）来调节培养基的 C/N，以研究适宜樟芝菌丝生长的C/N。从图4可以看出，在所研究的C/N范围内，C/N为10 ∶ 1以上时均适于樟芝菌丝生长，在C/N为（20～50） ∶ 1时菌丝生长最快。

2.4 不同矿质元素对樟芝菌丝生长的影响

从图5可以看出，矿质元素K、P、Mg、S、Na、Ca的缺乏均会明显影响樟芝菌丝的生长，即这6种元素均为菌丝生长必需的矿质元素。其中，缺Na、缺Ca对菌丝产量影响较小，而K、P、Mg、S的缺乏将极大程度地影响菌丝生长。

2.5 不同微量元素对樟芝菌丝生长的影响

从图6可以看出，7种微量元素（Fe、B、Zn、Mn、Mo、Cu、

Co）均对樟芝菌丝生长有一定的抑制作用，其中Fe、B元素对樟芝菌丝生长的抑制作用最为明显。

2.6 不同维生素对樟芝菌丝生长的影响

从图7可以看出，所添加的6种维生素均对樟芝菌丝的生长没有明显影响。

3 结论与讨论

本研究分析了樟芝液体发酵适宜的碳源、氮源、碳氮比及其所需的矿质元素和微量元素等，结果表明樟芝菌丝生长的最适无机氮源为酒石酸铵，最适有机氮源为麸皮；最适天然碳源为米粉，且以天然多糖类物质（木薯粉除外）为碳源处理的菌丝产量明显高于单糖、双糖、化学制剂多糖处理；菌丝生长适宜的碳氮比为（20～50） ∶ 1；K、P、Mg、S、Na、Ca均为菌丝生长必需的矿质元素；微量元素Fe、B、Zn、Mn、Mo、Cu、Co均对樟芝菌丝生长有一定的抑制作用，其中Fe、B元素的抑制作用最显著；添加维生素对菌丝生长无明显影响。

本研究中以蛋白胨为氮源处理的菌丝产量明显高于无机氮源处理。而黄大斌等研究发现，在琼脂培养基上以蛋白胨、酵母汁为氮源处理的菌丝生长速度不如柠檬酸铵、硝酸铵、硫酸铵等无机氮源处理[7]。因此，如果用琼脂培养基活化樟芝菌种，应采用无机氮源；如果进行樟芝菌丝体的液体发酵生产，则应采用有机氮源。

本研究表明，以葡萄糖为碳源处理的樟芝菌丝产量明显高于麦芽糖、半乳糖处理，且葡萄糖是仅次于天然多糖类物质的碳源。而黄大斌等研究表明，在琼脂培养基上，以葡萄糖为碳源处理的菌丝生长速度快于山梨醇糖、半乳糖、麦芽糖、淀粉处理[7]。因此，以葡萄糖作为碳源，不但适于樟芝菌种的活化，而且适于樟芝菌丝体的液体发酵生产。

本研究还表明，在樟芝的液体发酵培养基中不需要添加维生素。因此，可以推测在樟芝菌丝生长过程中，菌丝体会合成自身生长所需维生素。

参考文献：

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