茶树花不同发育时期的转录组分析

王泽涵, 于文涛, 王鹏杰, 樊晓静, 刘财国, 蔡春平, 叶乃兴

(1.福建农林大学园艺学院/茶学福建省高校重点实验室,福建 福州 350002；2.福州海关技术中心/福建省检验检疫技术研究重点实验室,福建 福州 350001)

茶树[Camelliasinensis(L.)O.Kuntze]起源于中国西南部地区[1]，是一种重要的多年生经济作物.茶叶因良好的口感和保健功效成为世界上最受欢迎的饮料之一[2].然而，茶树花作为茶树的副产品长期以来不被重视，直到近几十年茶树花的功效和用途才逐渐被发掘，其提取物已被证实具有多种生物活性，包括抗氧化和降血糖等功效[2,3-5]；同时，茶树开花有利于提高茶树品种的遗传多样性.因此对茶树花发育过程中的转录组学研究尤为重要.

成花转变是植物发育的关键期，已有很多关于植物开花诱导方面的研究[6].对模式植物拟南芥等研究表明，植物开花途径主要有光周期途径、春化途径、赤霉素途径和自主途径等[7-8].目前对茶树花的研究主要集中在生化成分分析、花青素提取和分子标记等方面，茶树花发育方面的研究很少.如：饶耿慧等[9]对茶树花不同发育时期的生化成分进行了测定；Liu et al[10]以‘瑞雪’为材料，对茶树花发育相关的基因和途径进行了转录组分析.‘黄棪’茶树品种(C.sinensis‘Huangdan’)为国家级良种，是福建省的主要栽培品种，以高香闻名，具有“透天香”的美称[11].本研究以‘黄棪’茶树品种花苞期和开放期的花作为试验材料，对其进行转录组测序分析，探究茶树花不同发育时期生长发育和生化成分代谢的分子机制，旨在为进一步了解茶树花发育提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料于2020年11月采自福建农林大学南山教学茶厂.选取无病害、长势良好的‘黄棪’茶树，分别取其花苞期和开放期的茶树花(图1)，各设3个重复，在液氮中固定后储存于超低温冰箱(-80 ℃)中.

A：花苞期；B:开放期.

1.2 RNA的提取

以整朵茶树花为材料进行RNA的提取，采用天根多糖多酚植物总RNA提取试剂盒，用Nano-Drop 2000型超微量分光光度计(赛默飞世尔科技有限公司)检测RNA样品的纯度、浓度和完整性，以保证后续数据分析的准确性.具体步骤参照谷梦雅等[12]的研究方法.

1.3 转录组测序与分析

首先用带有Oligo(dg)的磁珠富集mRNA，然后加入破碎缓冲液将mRNA进行随机打断，并以打断后的mRNA为模板，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA聚合酶Ⅰ合成第2条cDNA链，将其进行纯化及PCR扩增，构建cDNA文库.文库构建后，用Illumina平台进行测序.对原始数据加以过滤得到过滤数据，与最新基因组进行序列比对，再进行转录组重构，得到全部的转录本.

1.4 差异表达基因的筛选和富集分析

用DESeq2软件筛选差异表达基因[13]，以差异倍数(FC)≥2，且误错率(FDR)<0.01作为筛选标准，对筛选出的差异表达基因进行基因本体论(gene ontology, GO)功能富集分析及京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)代谢通路富集分析.当经过校正的P<0.05时，认为此GO和KEGG存在显著富集的情况.采用TBtools软件制作热图[14].

1.5 差异表达基因的qRT-PCR验证

采用茶树花两个发育时期提取的总RNA作为模板，设置了3次生物学重复.在Primer3plus网站(http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)上设计引物(表1)，用EasyScript One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)将RNA合成cDNA.选用茶树GAPDH(登录号：GE651107)作为内参基因.利用C1000型PCR仪(伯乐生命医学产品有限公司)进行荧光定量反应，反应程序：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环.用2-ΔΔCT算法计算处理.

表1 转录组数据qRT-PCR验证引物序列

2 结果与分析

2.1 茶树花测序质量及差异表达基因筛选结果

过滤掉茶树花两个测序样本数据的低质量读数后，获得135 039 271个过滤数据，产生40 421 627 328个过滤数据，GC含量为44.30%～45.35%，为正常水平；各样品Q30碱基百分比均不小于93.11%，测序质量较高.将各样品的过滤数据与茶树参考基因组进行序列对比，比对率均在87.27%及以上(表2)，可进行后续分析.

表2 茶树花测序数据统计结果

茶树花两个发育时期共鉴定出28 001个基因(图2A)，其中，共表达的基因有17 217个，花苞期特异表达的基因有8 859个，开放期特异表达的基因有1 925个，共表达的基因占61.5%，花苞期和开放期特异表达的基因分别占31.63%和6.87%，可以看出开放期的特异表达基因较花苞期少.对茶树花两个发育时期差异表达基因进行筛选，共筛选出18 352个，其中，上调的基因有8 019个，下调的基因有10 333个.从图2B可以清楚地看出茶树花两个发育时期基因表达水平的差异.

A：两个发育时期表达基因的韦恩图；B：两个发育时期差异表达基因的火山图.

2.2 茶树花不同发育时期差异表达基因GO功能富集结果

GO功能富集分析可分为生物过程、细胞组分和分子功能3大类.对茶树花两个发育时期的基因进行对比分析，共得到14 020个显著差异表达基因.富集最多的前54个GO功能分类如图3所示.在生物过程中，富集到22 765个差异表达基因，其中，富集最多的是代谢过程，其次是细胞过程、单个有机体过程和生物调节；在细胞组分中差异表达基因有22 756个，主要富集在膜、膜部分、细胞和细胞部分上；差异表达基因在分子功能中富集到15 529个，多数富集在绑定、催化活性和载体活性上.

生物过程(A：代谢过程；B：细胞过程；C：单个有机体过程；D：生物调节；E：定位；F：刺激应答；G：细胞成分组织或生物发生；H：多细胞生物的过程；I：信号；J：发育过程；K：生殖；L：生殖过程；M：多有机体过程；N：解毒；O：免疫系统过程；P：增长；Q：运动；R：生物节奏的过程；S：行为；T：细胞聚集；U：生物附着)；细胞组分(A：膜；B：膜部分；C：细胞；D：细胞部分；E：细胞器；F：细胞器部分；G：大分子复合体；H：膜密封腔；I：胞外区；J：其他有机体；K：其他有机体部分；L：细胞连接；M：共质体；N：超分子复合物；O：细胞外区域部分；P：类核；Q：突触；R：突触部分)；分子功能(A：绑定；B：催化活性；C：载体活性；D：核酸结合转录因子活性；E：结构分子活性；F：分子调节功能；G：抗氧化活性；H：分子传感器活性；I：电子载体活性；J：信号传感器活性；K：转录因子活性，蛋白质绑定；L：营养库活性；M：毒素活性；N：蛋白质标记；O：金属伴侣活性)

2.3 茶树花不同发育时期差异表达基因KEGG功能富集结果

进一步对茶树花两个发育时期的差异表达基因进行KEGG功能富集分析，筛选出富集最显著的20条代谢通路(图4).其中，植物激素信号转导、光合作用—天线蛋白、卟啉和叶绿素代谢、植物的昼夜节律这4条代谢途径与花的发育显著相关；此外，与生化成分形成相关的不饱和脂肪酸的生物合成、糖胺聚糖降解、脂肪酸生物合成、其他多糖降解及缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸合成代谢途径也显著富集.

图4 茶树花不同发育时期差异表达基因KEGG功能富集结果

在植物的昼夜节律代谢通路中有24个差异表达基因显著富集，其中，开放期中13个差异表达基因的表达量大于花苞期，尤其是LHY(CsTGY06G0001726)基因的表达量显著大于花苞期；在植物激素信号转导途径中，有16个差异表达基因显著富集，开放期中的SCL(CsTGY07G0002651)、DELLA(CsTGY12G0000626)和ACC(CsTGY15G0000376)3个基因的表达量显著大于花苞期，但bHLH(CsTGY01G0002809)基因在花苞期中的表达量较高；在卟啉和叶绿素代谢途径中，除了Glutr(CsTGY13G0001942)和ChlbreductaseNYC1(CsTGY06G0001166)这两个基因，其他5个基因UROS(CsTGY04G0002387)、UROD(CsTGY07G0000613)、MgCh(CsTGY11G0001825)、PPO(CsTGY01G0003741)和CPOX(CsTGY08G0002493)均是花苞期的表达量大于开放期；而在光合作用—天线蛋白途径中筛选出的差异表达基因均属于光合系统基因，其在两个发育时期的表达量呈现差异表达(图5).

A：植物的昼夜节律途径；B：植物激素信号转导途径；C：光合作用—天线蛋白途径；D：卟啉和叶绿素代谢途径.

2.4 茶树花转录组测序数据的qRT-PCR验证

为了进一步验证转录组数据的准确性，随机选取6个差异表达基因进行qRT-PCR验证.结果(图6)显示，随机挑选的6个差异表达基因荧光定量表达水平的变化与转录组基因丰度的变化基本一致，表明转录组数据具有较高的可靠性.

FPKM值表示每千个碱基的转录每百万映射读取的碎片.

3 讨论

植物激素是存在于植物体内的小分子化合物，对植物的生长发育具有调节作用[15-16].对不同发育时期茶树花的转录组进行分析发现，有大量的差异表达基因集中在植物激素信号转导途径上，且这些差异表达基因与生长素、乙烯和赤霉素等的生物代谢途径有关.植物生长素是第一个被发现的植物激素[17]，目前已知的参与生长素信号转导的蛋白有AUX/IAA转录因子、生长素响应因子ARF和SCF复合体参与生长素信号转导途径[18].朱利利等[19]研究表明，生长素在杜仲雄蕊原基发育时期表达上调，与本研究结果“生长素响应因子ARF在‘黄棪’花苞期多为上调”一致.同生长素一样，赤霉素也对植物的生长发育起调控作用，包括器官伸长和开花时间等.本研究中，在‘黄棪’花盛开期，DELLA蛋白的表达量显著大于花苞期，与杨敏[20]的研究结果“DELLA蛋白的表达量在枇杷末花期明显增加”相似.赤霉素通过降解DELLA蛋白来实现其功能，因此，上述原因的出现可能是由于开放期已经逐渐完成花的发育，赤霉素含量开始减少，导致DELLA蛋白增多.乙烯具有刺激开花和器官衰老脱落等功能，其中，ACC合酶是乙烯生物合成的关键酶[21].王哲等[22]研究表明，芍药的ACC含量在盛花期达到最大值；本研究结果显示，ACC合酶在‘黄棪’盛开期显著上调，推测乙烯促进了‘黄棪’花的盛开.

光周期途径是成花诱导的途径之一[23-24]，植物在感受到光周期后，通过生物钟调控开花基因的表达.生物钟蛋白基因LHY在光周期途径中起到昼夜节律钟的作用[25]，Millar et al[26]还发现拟南芥捕光叶绿素a/b结合蛋白基因Cab受昼夜节律的调控.在拟南芥中，光敏色素是主要的光信号感受器，可能通过PIF3调节LHY的表达，形成光信号向生物钟传递的途径之一[27].因此，LHY和Cab基因可能通过调控昼夜节律而促进开花.本研究结果表明，LHY和Cab基因在两个发育时期呈现差异表达，因此推测光周期途径可能是诱导茶树花发育的主要途径之一.本研究结果还显示，开花整合因子FT及一些调控花发育的转录因子，如MYB、bHLH、TCP、ZFP等，这些基因可能共同促进‘黄棪’花从花苞期到开放期的发育.此外，在‘黄棪’花开放期，叶绿素合成关键酶尿卟啉原Ⅲ合成酶UROS下调，而叶绿素b还原酶NYCI显著上调，表明在开花过程中，叶绿素含量逐渐减少，这也可能是随着花的开放花被颜色变白的原因.

茶树花含有氨基酸、糖类和茶多酚等生化成分.饶耿慧等[9]对茶树不同花期的生化成分含量进行测定，发现可溶性总糖含量随着花的发育增加，氨基酸含量减少.本研究结果表明:在糖胺聚糖降解、其他多糖降解及缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸合成代谢途径中茶树花开放期的表达量低于花苞期，推测随着花的发育，糖类的降解逐渐减少，导致开放期糖类的总含量大于花苞期;此外,由于开放期的表达量低于花苞期，开放期的氨基酸含量低于花苞期.

4 结论

本研究对‘黄棪’花的花苞期和开放期两个发育时期进行了转录组分析，结果表明：茶树花的发育受到生长素、赤霉素和乙烯等植物激素的调控，光周期诱导对其也有重要影响；茶树花的氨基酸含量和可溶性总糖含量随着花器官的发育发生了变化.本研究采用转录组测序技术分析茶树花两个发育时期在植物激素信号转导、光合作用—天线蛋白、植物的昼夜节律、糖胺聚糖降解等代谢途径上的表达差异，为茶树开花的分子调控机制提供参考.