施肥方式对木薯根际土壤细菌多样性与群落结构特征的影响

蔡 杰, 张 洁, 喻 珊, 林洪鑫, 李开绵, 陈松笔, 欧文军

(1.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业农村部木薯种质资源保护与利用重点实验室，海南 海口 571101；2.江西省农业科学院土壤肥料与资源环境研究所，江西 南昌 330200)

木薯(ManihotesculentaCrantz)是世界热区近10亿人口赖以生存的主粮，是世界第四大粮食作物，在全球105个国家中广泛种植.木薯是我国生产淀粉、变性淀粉、燃料乙醇等化工产品以及饲料的重要原料，是我国热区粮食生产的有效补充，也是“一带一路”发挥作用的有效桥梁[1].而盲目追求高产量以及长期或过量施用化肥造成一系列问题，如土壤肥力下降，土壤板结、养分过多流失，土壤细菌多样性和活性降低、水体富营养化等[2-5].因此，调整与优化木薯施肥方式，以及减少化肥施用量是今后种植木薯的必然趋势[6-8].

土壤微生物在维持农业生态系统可持续发展中扮演着重要的角色[9-10]，它与土壤质量、土壤肥力、土壤健康及生产力等因素紧密相关[11-13].而植物种类[14]、土壤类型[15]、种植模式[16]和施肥方式[7-8]等相关因素也制约根际微生物的多样性和群落结构.细菌是构成土壤根际微生物的重要菌群，其多样性和群落结构在某种程度上能够决定土壤质量、土壤肥力和土壤健康状况等[17].目前，关于木薯土壤根际微生物的研究报道并不多，主要探讨不同种植模式(间作或轮作)对木薯根际土壤微生物多样性和群落结构的影响[18-21].唐秀梅等[18]研究发现木薯与花生间作可改善根际土壤微生态环境，增加根际土壤微生物数量和种类.徐海强等[19]研究发现木薯与花生间作改变了木薯和花生根际土壤微生物的群落结构，但对其多样性影响不明显.刘珊廷等[20]研究发现木薯连作土壤的细菌丰度、多样性高于轮作土壤.木薯与花生间作，施用氮肥对木薯根际土壤细菌的多样性无显著影响，但对细菌群落组成的影响大于种植模式[21].关于施肥方式对木薯根际微生物多样性和群落结构影响的研究还未见报道.

本研究以木薯品种华南205为研究对象，采用Ion S5TMXL平台对木薯根际土壤进行16S rRNA高通量测序分析，探讨化肥减施和常规施肥的木薯根际土壤中微生物多样性和群落结构的变化情况，阐明不同施肥方式对木薯根际土壤微生物整体和各类群间的关系，为木薯减肥提质、增效推广和菌肥的开发利用提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 木薯根际土壤样品的采集与保存

2019年12月进行根际土壤样品的采集，采集方法参照文献[22].采样时使用的工具、采集袋或其他物品均已灭菌.设置6个采样点，按照S形取样，去除0～5 cm表层土壤，取5～10 cm处土壤，用1 mm土壤筛去除杂质，将其混合均匀.将采集的样品标记后置于冰盒中运回实验室，置于-80 ℃冰箱，用于DNA提取.

1.2 试验设计

试验基地位于江西省抚州市东乡区，东经116°49′11.33″，北纬28°22′51.63″N.该地区属于亚热带湿润气候，日照充足，试验区域为酸性红壤土，年平均气温18 ℃，年降雨量1 800～2 100 mm.本试验区划分为如下3个区.R1：未施肥区；R2：常规施肥区(15% N+15% P2O5+15% K2O复合肥)；R4：化肥减施区(在常规施肥基础上减氮25%，减磷50%).每个试验区栽种的木薯品种均为SC205.试验区面积20 m2，3次重复，共9个试验区.每小区种植5行，每行10株，每小区50株.小区间隔50 cm，重复间隔100 cm.

1.3 土壤DNA提取、PCR扩增及高通量测序

采用土壤DNA提取试剂盒(Omega公司提供)进行DNA提取.采用16S 引物进行目的基因PCR扩增.利用胶回收试剂盒回收目的条带，并进行高通量测序(送至北京诺禾致源科技股份有限公司).所有样本的原始数据上传至NCBI序列读取存档(SRA)数据库(登记号：SRR13357362).

1.4 数据预处理与样本差异分析

利用Cutadapt先对读取序列进行低质量部分剪切，再根据Barcode从先前处理的读取序列中分析各样品数据，通过初步QC得到原始数据，并进行去除嵌合体序列处理，读取序列，并与物种注释数据库进行比对，检测嵌合体序列，并将其去除，最终得到有效数据.利用Qiime软件(Version 1.9.1)计算Observed-OTUs、Chao1、Simpson、Shannon、Ace等指数，利用Kruskal-Wallis软件分析ɑ-多样性指数组间差异；采用Qiime软件计算Unifrac距离，构建UPGMA样本聚类树.使用R软件绘制PCoA图，进行多样本比较分析.

2 结果与分析

2.1 不同施肥方式下的测序结果

通过Ion S5TMXL平台进行16S rRNA高通量测序，将得到的原始数据过滤后进行分析，结果表明9个样本原始序列条数为701 130，平均每样品测得77 903条读取序列，去除嵌合体序列处理后，得到73 954条有效数据，质控有效率达94.71%，平均测序读长为400 bp.从图1可看出，随着序列数的增加，曲线趋于平缓，表示样本的OTU覆盖度已经达到饱和，能够反映样本的多样性.

图1 所有样本的稀疏曲线

2.2 不同施肥方式下根际土壤细菌的α-多样性

对化肥减量和常规施肥土壤的OTU和α-多样性指数进行分析，从表1可以看出，R2中Shannon和Simpson指数都高于R1，表明土壤细菌的多样性表现为R2>R1.但是R2的OTUs、Ace和Chao1等指数都低于R1，表明土壤细菌的丰度表现为R1>R2.R4根际土壤的OTUs、菌群丰度指数及多样性指数(Shannon、Simpson、Ace和Chao1)都低于R1，表明化肥减施后土壤中物种的数量细菌多样性和丰度都显著低于未施肥区，且化肥减量区根际土壤中微生物菌落丰度及多样性是最低的.表明施肥方式会改变土壤微生物的多样性和群落组成，其物种多样性由高到低依次为R1、R2、R4.

表1 不同施肥方式下木薯根际土壤样品细菌的多样性和丰度指数1)

2.3 不同施肥方式下根际土壤细菌的OTU韦恩图

不同施肥方式下根际土壤细菌共同的OTUs有1 026个(图2).但是不同施肥方式下每个样本特有的OTUs数量相对较少，R1、R2、R4分别为82、57、31个.特有的OTUs的数量呈现降低的趋势，与总OTUs数量降低的趋势一致.结果表明，不同施肥方式改变了木薯根际细菌的丰度与群落结构.

图2 不同处理OTUs分布的韦恩图

2.4 不同施肥方式下根际土壤细菌群落的Beta多样性

基于Unifrac距离对不同施肥方式下根际土壤成分进行主坐标分析(PCoA)，结果表明第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的贡献率分别为54.58%和23.12%(图3).一般情况下，主坐标分析二维图中不同样本的距离越近，不同样本中物质组成多样性越相似.样本R1和R2距离相近(聚集在一起)，说明这两个样本间的物种组成多样性较为相似；但是R4与R1、R2距离较远，说明R4与R1和R2样本的微生物群落多样性有较大差异.进一步对不同样本进行Beta多样性的聚类分析(UPGMA)，结果表明样本R1和R2微生物群落多样性较为相似，R4微生物群落与R1和R2两个样本微生物群落多样性有所区别，这说明化肥减量在某种程度上改变了细菌的相对丰度与群落结构(图4).

图3 不同施肥方式下木薯根际土壤细菌群落PCoA分析

图4 不同施肥方式下木薯根际土壤细菌群落的聚类分析

2.5 不同施肥方式下根际土壤的主要细菌组成

为了得到每个OTUs对应物种的分类信息，利用SILVA数据库对97%相似水平的OTUs代表序列进行分类学比对，发现注释到界水平的比例为100%，门水平的比例为92.65%，纲水平的比例为85.94%，目水平的比例为73.71%，科水平的比例为65.58%，属水平的比例为35.90%，种水平的比例为8.06%.

在门分类水平，酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinbacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)是木薯根际土壤样本的优势菌门(图5).与R1根际土壤细菌群落相比，R2和R4区根际土壤细菌(绿弯菌门、变形菌门、放线菌门和厚壁菌门)的含量呈现升高的趋势，但R2和R4根际土壤中酸杆菌门和拟杆菌门的相对丰度呈现下降的趋势.而R2和R4中放线菌门的相对丰度有所增长，尤其是化肥减施后相对丰度显著增加(P<0.05)，分别是未施肥区中放线菌门丰度的1.27倍和1.86倍；厚壁菌门的相对丰度有所增加，尤其是化肥减施后相对丰度显著增加(P<0.05)，分别是未施肥区与常规施肥区中厚壁菌门丰度的5.96倍和10.41倍.化肥的施用方式未改变主要细菌的类别，但提高了土壤中有益细菌的相对丰度.

图5 门水平上的细菌相对丰度

3 讨论

土壤微生物群落组成受宿主植物、微生物与土壤理化环境互作的影响[23].本研究通过高通量测序分析了同一土壤条件下不同施肥方式对土壤细菌群落结构组成和多样性的影响.本研究中两种施肥方式下木薯根际土壤样本的优势菌群分别是酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinbacteria)等，这与刘珊廷[20]、林洪鑫[21]和韦云东[24]等结果一致，但是优势菌落的丰度并不相同.这也表明了根际微生物群落结构和多样性也受到植物种类、土壤类型等因素影响.本研究中，化肥减施处理下木薯根际土壤中，细菌的多样性和丰度都显著低于未施肥与常规施肥处理，与靳晓拓[6]和孙家骏[25]等研究结果不一致.主要原因是在化肥减施处理基础上加施有机肥，施用适量有机肥能够显著提高土壤中有机碳、氮和磷含量，有利于微生物的繁衍，一定程度上提高了土壤细菌菌群的多样性，改变土壤细菌群落结构[26].本研究土壤为南方地区典型的红壤土，后续研究将通过添加有机肥、土壤修复剂或蚯蚓[27]等来调节土壤pH值，改善土壤根际微生物群落.

不同施肥方式会影响植物有益或有害微生物类群的相对丰度[16,28].本研究中，化肥减施和常规施肥两种施肥方式增加了放线菌门的丰度，与王庆[29]、姜蓉[30]的研究结果一致.值得注意的是放线菌是一类具有重要生物活性的功能性微生物，它在各种生态环境中广泛存在，能产生种类繁杂和富含生物活性的次级代谢产物，还能产生各类酶、有机酸等，有助于分解有机物和矿物质[31]；同时它具有良好的抗菌活性和耐盐碱作用[32,33].R2和R4处理下木薯平均产量分别为15.033和15.677 t·hm-2，都显著高于R1的木薯产量(9.991 t·hm-2).化肥的施用可通过提高土壤有益微生物的多样性，改变土壤微生物的群落结构，维持土壤微生物稳态，促进木薯的生长，从而增加木薯的产量.

基于土壤细菌群落的PCoA和聚类分析，发现木薯土壤根际微生物群落分成两大类，R1和R2群落结构相似，但与R4不同.这说明了常规施肥只改变木薯根际微生物的丰度，微生物群落结构并无太大的变化.但是化肥减施不仅降低了木薯根际微生物的丰度，还改变了微生物群落结构，这与桑文等[34]的研究结果一致.

综上所述，不同施肥方式不仅改变木薯根际土壤细菌的多样性与相对丰度，也在一定程度上改变木薯根际土壤的细菌群落结构.化肥减施处理下木薯根际土壤的细菌丰度和多样性与未施肥、常规施肥处理的根际土壤有显著的差异，如化肥减施处理的根际土壤中放线菌门和厚壁菌门的含量显著高于常规施肥和未施肥的土壤.