CCDC134调控人牙髓干细胞成骨分化

徐万田，董文睿，朱文胤

南京大学医学院附属口腔医院，南京市口腔医院第三门诊部，江苏 南京（210008）

颌面部骨缺损修复与再生是组织工程与再生医学的研究热点。选择合适的种子细胞，并通过外源性调控使其获得更好的成骨分化功能具有重要意义。

人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）为牙源性间充质干细胞，具有自我更新能力、多向分化潜能，免疫原性低，可通过拔除的第三磨牙、正畸牙获得，来源较为充足，且与颌面部骨组织具有同源性，因此被视为颌面部骨缺损修复与再生的重要种子细胞［1］。

CCDC134（coiled-coil domain containing 134）是新发现的一种骨调控分子，其表达缺失可影响成骨细胞的骨向分化和骨基质形成，在成骨调控中发挥重要作用［2］。骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）/Smad家 族 成 员1（mothers against decapentaplegic homolog 1，SMAD1）信号通路是骨代谢中的重要通路，具有正向调控成骨分化的功能［3］。

本实验拟通过上调/下调CCDC134，观察其对hDPSCs成骨分化的影响，以及CCDC134与BMP-2/SMAD1信号通路的关系，为hDPSCs在颌面部骨缺损修复与再生中的应用提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

α-MEM培养基、胰蛋白酶（Gibco，美国）；胎牛血清（四季青，中国）；成骨诱导液、细胞聚合体诱导液、ALP染液、茜素红染液（碧云天，中国）；Trizol reagent（Invitrogen，美 国）；逆 转 录 试 剂 盒（Toyobo，日本）；BMP-2、Dorsomorphin、HA/TCP（Sigma，美国）；慢病毒（锐博，中国）；人Stro-1抗体（ab214086，Abcam，英国）；CD105抗体（ab11414，Abcam，英国）；CD34抗体（ab187282，Abcam，英国）；CD45抗 体（ab25386，Abcam，英 国）；人CCDC134抗体（MAB7784-SP，R&D，美国）；RUNX2抗体（sc-390351，Santa Cruz，美国）；OCN抗体（sc-390877，Santa Cruz，美国）；BMP-2抗体（sc-137087，Santa Cruz，美 国）、SMAD1抗 体（sc-7965，Santa Cruz，美国）；GAPDH抗体（sc-47724，Santa Cruz，美国）；实时定量PCR仪（CFX96，Bio-Rad，美国）；流式细胞仪（FACSCanto II，BD，美国）。

1.2 实验分组和方法

1.2.1 hDPSCs分离培养与鉴定 选取就诊患者中需要拔除的新鲜阻生第三磨牙或正畸减数牙，分离牙髓，并将牙髓组织切割为小碎块，采用组织块-酶消化法，配合有限稀释法，分离培养hDPSCs。以P3代细胞进行实验。

本实验获得南京大学医学院附属口腔医院伦理委员会批准（NJSH-2021NL-003）。所有阻生第三磨牙或正畸减数牙来源的患者，均已签署知情同意书。

对分离hDPSCs进行鉴定：①流式细胞仪检测表面标志物Stro-1、CD105、CD34和CD45；②hDPSCs克隆形成检测，将500个细胞接种于5 cm培养皿，14 d后固定细胞，甲苯胺蓝染色；③成骨诱导及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色检测、茜素红染色（详见1.2.4）；④成脂诱导及油红染色检测成脂能力（详见1.2.5）。

1.2.2 慢病毒感染hDPSCs与实验分组 以5×104个/mL的密度将hDPSCs接种于6孔培养板中，细胞生长融合至底面积的约80%时加入慢病毒感染。CCDC134低表达慢病毒（shCCDC134）和过表达慢病 毒（CCDC134）的 靶 序 列 分 别 为5′-CTTCCAGAACCCATTTAAA-3′，5′-CAATGCACAGGGCTGCAGTCTAA-3′，病毒滴度＞108PFU/mL。6 h后换液，72 h后收集感染细胞。

将hDPSCs分为4组，分别为空白对照组、阴性对照组、CCDC134下调组（shCCDC134）、CCDC134过表达组（CCDC134）。空白对照组细胞不感染任何慢病毒；阴性对照组细胞感染空白质粒慢病毒；shCCDC134组细胞感染CCDC134低表达慢病毒；CCDC134组细胞感染CCDC134过表达慢病毒。

1.2.3 BMP-2信号激活及抑制 hDPSCs感染了CCDC134低表达慢病毒或CCDC134过表达慢病毒后，诱导细胞聚合体形成，在细胞贴壁时将细胞分为4组，分别为：①shCCDC134组，加入等量溶剂；②shCCDC134+BMP-2组，加入BMP-2信号通路激活剂BMP-2（100μM）；③CCDC134组，加入等量溶剂；④CCDC134+Dorsomorphin组，加入BMP-2信号通路抑制剂Dorsomorphin（200μM）。

1.2.4 成骨诱导及ALP染色检测、茜素红染色 将1×105个细胞接种于12孔培养板中，待细胞贴壁后更换成骨诱导液，每2 d换液1次，14 d后固定细胞，ALP染液染色15 min，观察染色情况，28 d后固定细胞，茜素红染液染色10 min，PBS缓冲液洗涤染液，显微镜下观察矿化结节形成。

1.2.5 成脂诱导及油红染色检测成脂能力 将1×105个细胞接种于12孔培养板中，待细胞贴壁后更换成脂诱导液，每2 d换液1次，7 d后，固定细胞，油红染液染色10 min，PBS缓冲液洗涤染液，显微镜下观察脂肪滴形成。

1.2.6 qPCR检测相关基因mRNA水平 Trizol法提取hDPSCs总RNA，逆转录获得cDNA（反应条件：37℃，5 min×3；50℃，5 min×3；98℃，5 min），实时定量扩增（反应条件：95℃，3 min；95℃，15 s；60℃，30 s；39个循环）。引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.7 Western blot检测相关蛋白水平 超声震荡联合反复冻融法提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取等量蛋白于SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，4℃孵育CCDC134、Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）、骨钙素（osteocalcin，OCN）、BMP-2、SMAD1一抗工作液（1∶500）8 h，PBS洗涤，室温孵育二抗1 h，PBS洗涤，PVDF膜显影。

1.2.8 裸鼠皮下成骨实验 将BMP-2信号激活剂（BMP-2）和抑制剂（Dorsomorphin）分别干预后的CCDC134下调及上调hDPSCs以1×105个/孔接种于12孔培养板中，待细胞贴壁后更换细胞聚合体诱导液，每2 d换液1次，待细胞聚合体形成后，将羟基磷灰石/磷酸三钙颗粒包裹于细胞聚合体中，移植于裸鼠皮下。2个月后，取材脱钙，行HE染色。

1.3 统计学方法

用SPSS19.0统计分析数据，检验数据的正态性和方差齐性，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为有统计学差异。

2 结 果

2.1 hDPSCs的细胞鉴定

hDPSCs高表达间充质来源的表面标志物Stro-1（98.67%）和CD105（98.51%），低表达造血系来源的表面标志物CD34（0.34%）和CD45（0.27%）。hDPSCs可形成细胞克隆，在成骨或成脂诱导条件下，可产生矿化结节或脂肪滴。以上结果说明hDPSCs分离培养成功，可进行后续实验。见图1。

Figure 1 Identification of hDPSCs图1 hDPSCs的鉴定

2.2 成骨诱导条件下hDPSCs中CCDC134的mRNA和蛋白表达水平

成骨诱导条件下，hDPSCs中CCDC134的mRNA水 平（P＜0.001）和 蛋 白 表 达 水 平（P＝0.021）的表达均上升。见图2。

Figure 2 Expression of CCDC134 in hDPSCs after osteogenic induction图2 成骨诱导条件下hDPSCs中CCDC134的表达水平

2.3 慢病毒感染后hDPSCs中CCDC134的表达水平

与空白对照组相比，阴性对照组的CCDC134的mRNA和蛋白表达水平无明显变化（P＝0.364）。与阴性对照组相比，shCCDC134组CCDC134的mRNA水平（P＜0.001）和蛋白（P＝0.015）水平表达显著降低，而CCDC134组的mRNA（P＜0.001）和蛋白（P＝0.008）表达量显著升高，见图3。

Figure 3 Expression of CCDC134 in human dental pulp stem cells after lentivirus transfection图3 慢病毒感染后人牙髓干细胞的CCDC134表达水平

2.4 CCDC134对hDPSCs成骨分化功能的影响

与空白对照组相比，阴性对照组的ALP染色和矿化结节形成无明显差异（P＞0.05）；与阴性对照组相比，shCCDC134组的ALP染色（P＜0.001）和矿化结节形成（P＝0.001）显著降低；而CCDC134组的ALP染色（P＜0.001）和矿化结节形成（P＝0.018）显著增加。

与空白对照组相比，阴性对照组的成骨分子RUNX2和OCN的mRNA水平和蛋白表达水平也无明显变化（P＞0.05）；与阴性对照组相比，shCCDC134组的RUNX2和OCN的mRNA水平（RUNX2：P＝0.001，OCN：P＜0.001）和蛋白表达水平（RUNX2：P＜0.001，OCN：P＝0.001）均降低，差异具有统计学意义；而CCDC134组的RUNX2和OCN的 的mRNA水 平（RUNX2：P＜0.001，OCN：P＜0.001）和蛋白表达水平（RUNX2：P＝0.001，OCN：P＜0.001）均升高，差异具有统计学意义，见图4。

Figure 4 Effect of CCDC134 on osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells图4 CCDC134对人牙髓干细胞成骨分化功能的影响

2.5 CCDC134通过BMP-2/SMAD1信号通路调控hDPSCs成骨分化功能

与空白对照组相比，阴性对照组的BMP-2和SMAD1的蛋白表达水平的表达无显著差异（P＞0.05）；与阴性对照组相比，shCCDC134组的BMP-2和SMAD1的蛋白表达水平（BMP-2：P＝0.036，SMAD1：P＝0.039）均降低，差异均具有统计学意义；而CCDC134组的BMP-2和SMAD1蛋白表达水平（BMP-2：P＜0.001，SMAD1：P＝0.002）均升高，差异具有统计学意义，见图5。

Figure 5 Expression level of BMP-2/SMAD1 signal pathway protein in human dental pulp stem cells after lentivirus infection图5 慢病毒感染人牙髓干细胞后BMP-2/SMAD1信号通路蛋白表达水平

与shCCDC134组相比，shCCDC134+BMP-2组成骨分子RUNX2和OCN的mRNA水平（RUNX2：P＜0.001，OCN：P＜0.001）与 蛋 白 表 达 水 平（RUNX2：P＜0.001，OCN：P＜0.001）升高，裸鼠皮下异位成骨增加（P＝0.001），差异具有统计学意义；与CCDC134组相比，CCDC134+Dorsomorphin组RUNX2和OCN的mRNA水平（RUNX2：P＜0.001，OCN：P＜0.001）与蛋白表达水平（RUNX2：P＝0.001，OCN：P＜0.001）均降低，裸鼠皮下异位成骨减少（P＝0.012），差异具有统计学意义，见图6。

Figure 6 CCDC134 regulates the osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells through BMP-2 signaling pathway图6 CCDC134通过BMP-2信号通路调控人牙髓干细胞的成骨分化能力

3 讨 论

hDPSCs是一类重要的牙源性种子细胞，研究表明hDPSCs具有成骨分化潜能［4-5］，在骨组织修复与再生中发挥作用［6-10］，因此，明确其成骨分化的分子机制对于精准调控种子细胞功能，促进骨组织修复与再生具有重要意义。

CCDC134是新发现的一种高度保守的分子，在胚胎发育过程中参与心脏、脑、肝脏等多种重要组织器官的代谢，其表达缺失可导致这些重要脏器的发育和功能障碍［11］。CCDC134的高度保守性保证了其可以从动物实验延伸至人源性样本的研究。研究表明，过表达CCDC134可以显著改善小鼠关节炎的症状［12］。不仅如此，CCDC134表达缺失可导致多种成骨相关基因的表达异常，进而导致严重的骨发育不全［2］。此外，CCDC134基因突变可造成患Ehlers-Danlos综合征母亲所怀胎儿的骨折，甚至是致死性骨折［3］。以上研究均提示CCDC134在骨发育与代谢中具有关键作用。

本实验首先对进行了hDPSCs鉴定，显示其间充质干细胞表面标志物高表达，造血干细胞表面标志物低表达，同时具有自我更新和多向分化潜能，以确保后续实验的可靠性。其次，发现hDPSCs成骨过程中的CCDC134表达增高，提示其在成骨中起重要作用；并通过慢病毒调控hDPSCs中CCDC134的水平，发现过表达CCDC134可以显著增强hDPSCs的成骨分化能力，为精准调控hDPSCs在骨组织工程中的作用，提供了新的靶点。

研究显示，CCDC134可调控细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）以及丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路在其他骨组织细胞中发挥作用［13-14］。例如，CCDC134突变可以引发ERK1/2磷酸化，抑制成骨相关分子骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、Ⅰ型胶原α链（collagen type I alpha 1 chain，COL1A1）的表达，进而导致成骨细胞分化异常［2］。也有研究报道CCDC134不直接调控MAPK信号通路［13］，这可能与两项研究选用的疾病模型和细胞种类不同有关。除以上信号通路外，BMP-2/SMAD1信号通路也是参与细胞骨代谢的重要信号通路，可以促进成骨细胞［15-16］、间充质干细胞［17-20］的成骨分化，其与CCDC134的相关研究尚未见报道。本实验结果发现，过表达CCDC134可上调BMP-2/SMAD1信号的表达，而抑制CCDC134则下调该信号的表达，提示BMP-2/SMAD1是CCDC134的下游信号通路。此外，通过BMP-2信号的激活和抑制，可以有效逆转CCDC134低表达慢病毒或过表达慢病毒对hDPSCs的作用，从而明确了CCDC134可通过BMP-2/SMAD1信号通路调控hDPSCs的成骨分化。

辅助性T细胞1（helper T cell 1，Th1）和辅助性T细胞17（helper T cell 17，Th17）是两类重要的免疫细胞，在骨代谢的负向调控中起重要作用，二者的活化直接或间接影响成骨和破骨过程［21-22］。研究显示，CCDC134可以抑制Th1和Th17细胞的功能，并能有效控制骨关节炎的发展［12］，这也提示CCDC134调控骨代谢的另一潜在机制。此外，CCDC134还能通过与转录激活因子hADA2a（human alteration/deficiency in activation 2a）相互作用，抑制其诱导的细胞凋亡和细胞周期抑制，发挥保护细胞的作用［23］。另有研究发现，CCDC134通过调控Wnt信号通路，在神经系统发育及运动神经的协调中发挥关键作用，而hDPSCs为神经嵴来源的细胞，与神经系统具有同源性，可能具有类似的信号调控途径［24］。

本实验明确了CCDC134在hDPSCs成骨分化中的作用及相关分子机制，进一步完善了CCDC134调控成骨分化的信号网络，为多方位调控hDPSCs的成骨分化功能，促进其在颌面部骨缺损修复与再生中的应用提供实验依据。