基于网络药理学和分子对接研究丹芎活血片治疗骨性关节炎的机制

郭晋言 梁铭林 黄煜智 曾豪杰 陈倩文 杨 春▲ 杜以宽

1.广东医科大学干细胞与再生组织工程重点实验室，广东东莞 523808；2.广东省东莞市人民医院中心实验室，广东东莞 523059

骨性关节炎（osteoarthritis，OA）是由于关节先天性异常、关节畸形等因素引起关节软骨退化损伤[1]，主要通过口服药物与手术缓解症状[2]，但治疗的相关不良反应多[3]。既往研究[4]证实，中药在治疗OA、改善生存质量、明显延长无病生存期等方面发挥积极作用。骨关节炎属中医学 “痹证” 或 “瘘证” 范畴[5]，正气不足是其发病内因，湿、热、寒、风是其发病外因[6]，治疗以补肝肾、盈气血为主。

丹芎活血片是蔡立民教授根据多年临床辨证经验提出的成方，其采用活血化瘀、固正扶阳的方法，正切中病机，研究显示其抗凝效果确切，能通过促进局部的血液循环改善关节功能，显著提高患者生存质量，但具体作用机制仍需进一步研究[7]，而采用单一的机制研究不能体现丹芎活血片治疗OA 的整体性与多向性。网络药理学将药物作用靶点和疾病靶点结合，建立疾病、靶点、药物及通路之间的相互作用网络，从而全面系统地分析药物的作用机制[8]。因此本研究对丹芎活血片进行网络药理学研究，旨在为后续基础与临床研究提供分子机制基础。

1 材料与方法

1.1 筛选丹芎活血片的成分与靶标

检索TCMID 数据库（http://tcmspw.com/tcmsp.php）和SymMap 数据库（https://www.symmap.org/），收集既往文献中当归[9]6 个成分、丹参[10]6 个成分、川芎[11]6 个成分、苏木[12]4 个成分、土鳖虫[13]5 个成分、血竭[14]6个成分、泽兰[15]5 个成分、路路通[16]5 个成分、粉防己[17]1 个成分、桑枝[18]6 个成分。以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（drug-likeness，DL）≥0.18 为条件，得到成分并查询对应的靶点。

1.2 筛选OA 的靶点

在Gene Cards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）、DisGeNET（https://www.disgenet.org/）等数据库检索 “Osteoarthritis”，获得疾病靶点。

1.3 “中药-成分-靶点” 网络的构建

用Venny 对药物与疾病靶点取交集获得共同靶点，并在Cytoscape 3.7.2 构建 “中药-成分-靶点” 网络。采用Cytoscape 分析网络。

1.4 蛋白质-蛋白质交互网络的构建

在STRING（https://string-db.org/）构建蛋白质-蛋白质交互（protein-protein interaction，PPI）网络，获得核心网络模块。

1.5 基因本体与京都基因与基因组百科全书途径富集分析

借助DAVID 数据库（https://DAVID.ncifcrf.gov/）进行基因本体（gene ontology，GO）、京都基因与基因组百科全书途径富集（Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway enrichment，KEGG）分析，用于预测药物治疗OA 的生物过程。

1.6 “成分-靶点-通路” 网络的构建

将成分、靶点和信号通路导入微生信网站（http://www.bioinformatics.com.cn）构建网络图，筛选排名前5位的成分进行分子对接验证。

1.7 有效成分-靶点分子对接

利用LEDOCK 分子对接软件，将有效成分与核心靶点进行分子对接验证。

2 结果

2.1 活性成分获取

筛选得到丹芎活血片的活性化合物50 个（表1），对应的靶点1128 个。

表1 丹芎活血片的成分信息表

2.2 疾病靶点

筛选得到丹芎活血片的疾病靶点774 个。用Venny 取药病靶点交集，得到50 个共同靶点，见图1。

图1 药物与OA 靶点交集的韦恩图

2.3 “药物-化合物-靶点” 网络图

该网络图度值排名前5 的有效成分为槲皮素，山柰酚，姜黄素，阿魏酸，藁本内酯（图2），这可能是治疗OA 的活性成分。

图2 “药物-化合物-靶点” 网络

2.4 PPI 结果

在阈值≥0.7 中，Cytoscape 3.7.2 筛选出STAT3、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、JUN 有密切联系；在0.9 的高度阈值中，筛选显示STAT3、VEGFA、IL-6、TNF、JUN、MMP9 是核心成分（图3），以此作为分子对接的靶点。

图3 PPI 网络图

2.5 GO 和KEGG

本研究中，GO 结果显示，分子功能富集于聚合酶Ⅱ启动子转录阳性、细胞质、蛋白质结合等（P<0.05）（图4，封四）。KEGG 结果显示，在癌症、乙型肝炎、核因 子κB （nuclear factor κB，NF -κB）、PI3K -Akt 和JAK-STAT 信号通路中富集（图5）。

图4 GO分析图（见内文第5页）

图5 KEGG 分析图

2.6 “成分-靶点-通路” 网络图

将成分、靶点、前10 条通路使用Cytoscape 3.7.2构建 “成分-靶点-通路” 网络图。前5 个成分为阿魏酸、芥子酸、异阿魏酸、姜黄素、山柰酚（图6），以此作为分子对接的成分。

图6 “成分-靶点-通路” 网络图

2.7 分子对接

以6 个核心靶点与5 个有效成分进行分子对接（图7），结果显示，STAT3、VEGFA、IL-6、TNF、JUN、MMP9 的结合能均小于-5 kJ/mol，说明有较好的结合活性。

图7 药物和靶点的分子对接过程图

3 讨论

本研究通过网络分析，得到的槲皮素、山柰酚、姜黄素、阿魏酸已有文献证明对OA 有疗效，并通过PPI获得STAT3、MMP、IL-6、TNF、JUN。其中IL-6 严重破坏关节软骨组织平衡，而TNF-α 可以阻断软骨胶原的合成，导致软骨基质降解和破坏[19]。槲皮素可降低IL-6、IL-1β 和TNF-α 的分泌水平，并在蛋白水平下

调Nlrp3、caspase-1、proIL-1β 和IL-1β 的表达[20]，表现其抗氧化性和抗炎活性，从而治疗OA[21]。山柰酚可抑制bFGF-FGFR3-RSK2 信号抑制类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞的增殖和迁移，抑制活性T 细胞介质的炎症细胞因子（如IL-17、IL-21 和TNF-α）的释放[22]，而Tanideh 等[23]在利用山柰酚治疗前交叉韧带横切术（anterior cruciate ligament transection，ACLT）诱导的大鼠的实验中，发现大鼠体内的MMP-13、MMP-3、TNF-α、IL-1 明显降低。姜黄素同样可以充当抗炎药，抑制软骨细胞中NF-κB 介导的IL-1β/TNF-α 分解代谢信号通路[24]，由此可见，丹芎活血片中的活性成分能从多方面抑制关节病变的过程，从而发挥治疗OA 的作用。

KEGG 结果显示，调节PI3K/AKT 信号通路可以治疗OA。OA 患者中miR-146a-5P 表达增加，促进软骨细胞凋亡和炎症反应[25]。在OA 大鼠模型中，山柰酚抑制了miR-146a 和Decorin 在软骨组织中的表达，从而激活PI3K/Akt/mTOR 信号通路，与KEGG 的结果一致[26]。NF-κB 信号通路也与治疗OA 相关，槲皮素通过抑制TNF-α 和NF-κB 之间的正反馈调节，从而起到治疗OA 的作用[27]。为了客观展示药物治疗OA的分子机制，本研究结合了药物与疾病的映射靶点和信号通路的结果，绘制了科学假说图（图8，封四），为全面深入地了解作用机制奠定了基础。

本研究借助网络药理学技术，预测槲皮素、山柰酚、姜黄素、阿魏酸通过靶向PI3K/Akt、NF-κB 信号通路中的TNF、NF-κB、AKT 等分子起作用，从分子水平方向揭示了丹芎活血片治疗OA 的潜在作用机制，为后期药物研发及疾病治疗提供一定理论依据。