不同方式的碱烧伤对诱导兔角膜新生血管生成的比较

王丽君 刘伊琳 宋 斌 孙洪坤

1 滨州医学院附属医院眼科 山东 滨州 256603；2 山东大学附属省立医院眼科 山东 济南 250021；3 滨州医学院附属医院血液内科 山东 滨州 256603

角膜之所以能维持透明状态，主要取决于角膜基质层没有血管[1]。角膜受到创伤、感染及其他免疫性疾病的刺激后，角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)便会自角膜缘向角膜中央呈病理性生长，进而降低病变区域角膜的透明度，从而导致视力下降[2]。CNV形成的病理生理过程是非常复杂的[3]。角膜炎症反应是CNV形成的主要原因之一[4]。角膜碱烧伤是诱导CNV形成的经典方法，其常用的烧伤部位为中央或周围角膜[5]。但对于不同浓度的碱烧伤，其作用的部位不同来诱导CNV形成的成功率的比较目前尚未见报道。本研究将对此进行深入探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物 120只纯种新西兰大白兔，购自山东农业科学院(山东济南)，月龄为2～3个月，体质量为1.5～2.0 kg，雌雄不限。裂隙灯显微镜下排除眼前节病变。本研究动物实验经山东大学动物研究伦理委员会批准，伦理批准号为19075。

疼痛的范围符合分布规律,有明显压痛者应进行神经阻滞试验,该方法具有诊断性治疗作用。此试验阳性是早期诊断本病的特征表现之一。

1.2 实验方法 采用随机抽签法将家兔随机分为6组，每组20只。所有家兔均选择右眼作为碱烧伤模型，左眼作为对照眼。造模方法为选用3%戊巴比妥钠(1 mL/kg，天津金药)行静脉注射麻醉，爱尔凯因滴眼液行表面麻醉2次。用棉签擦干结膜囊和角膜表面，取直径为6 mm的圆形滤纸，置于1.0、1.5、2 mol/L的NaOH溶液中浸泡15 s，然后用干滤纸吸附滤纸中多余的液体。用0.9%生理盐水充分冲洗结膜囊1 min。用滤纸在规定的位置将规定浓度NaOH涂于角膜表面30 s，术后分别用氧氟沙星眼膏涂抹双眼。各组处理如下：2M+P组将2 mol/L NaOH作用于周边角膜(periphery cornea)的角膜缘处；2M+C组将2 mol/L NaOH作用于中央角膜(central cornea)；1.5M+P组将1.5 mol/L NaOH作用于周边角膜的角膜缘处；1.5M+C组将1.5 mol/L NaOH作用于中央角膜；1M+P组将1 mol/L NaOH作用于周边角膜的角膜缘处；1M+C组将1 mol/L NaOH作用于中央角膜。见图1。

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A. 作用位置为周边角膜，滤纸边缘与角膜缘相切；B. 作用位置为中央角膜，滤纸作用于角膜中央。

1.3 检测指标

角膜混浊程度与NaOH浓度有关，1M+P组和1M+C组的角膜混浊程度明显低于其他组。烧灼位置为中央角膜的各组的角膜混浊程度低于烧灼位置为周边角膜的各组，但差异无统计学意义。在较高NaOH浓度(1.5、2 mol/L)的情况下，烧灼位置为周边角膜的各组的水肿程度低于烧灼位置为中央角膜的各组，但差异无统计学意义。CNV模型的成功率取决于NaOH浓度及其灼烧于角膜位置。在相同NaOH浓度作用下，烧灼位置为周边角膜的模型成功率更高，而在相同烧灼位置下，较高浓度的NaOH更容易提高CNV模型的成功率(表1)。

1.4 统计学方法 应用SPSS 20.0进行数据处理，所应用统计方法包括卡方检验、Fisher精确检验、方差分析及线性相关分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

1.3.2 CNV面积的测量 碱烧伤后第14天用数码相机(Canon 5D mark 2，日本)记录CNV形态。用image pro plus(IPP)软件(6.0版Windows，Media Cybernetics，美国)测量CNV面积与角膜溃疡面积。模型建立失败的标准为第5天未观察到CNV。

2 结果

并网光伏发电系统用正弦波电压源型逆变器结构通常如图1所示，主要由前级DC/DC变换器和后级DC/AC逆变器组成，其原理是根据升压技术将低压直流电变换成高压直流电，然后通过逆变电路输出220 V交流电[3]3.

所用家兔均未见角膜溶解与角膜穿孔。

1.3.1 角膜混浊及角膜水肿的评分 碱烧伤后第14天在裂隙灯显微镜下观察角膜混浊及角膜水肿情况，采用Yoeruek等[6]的方法对每个角膜按照角膜水肿及角膜混浊的程度进行分级。角膜混浊度分级为：0级，透明；1级，混浊极少，可清晰透见虹膜纹理及瞳孔；2级，轻度混浊，虹膜可见，但纹理不清晰；3级，中度混浊，虹膜模糊，隐约不可见；4级，重度混浊，虹膜及瞳孔看不清。角膜水肿分级为：0级，无水肿；1级，轻中度水肿；2级，严重水肿。

当然，读书多思，还只是一端，多思还必须求证。你的思考是否正确，还必须得到证明，这证明一是靠前辈学者研究的成果，包括古人的笺疏；二是靠你再查各种资料，包括《辞海》之类的工具书和其他可以确证的资料，决不能自以为是，只凭自己的理解，不求确证是不科学的。

表1 不同组间CNV模型的成功率比较

碱烧伤后第14天，2M+P组，2M+C组，1.5M+C组，1.5M+C组CNV的面积和角膜溃疡的面积见表2。对于上述两个指标分别进行单因素方差分析，差异均有统计学意义(FCNV面积=16.91，PCNV面积<0.05；F角膜溃疡面积=58.78，P角膜溃疡面积<0.05)，而组间两两比较，P均<0.05。结果显示，烧灼位置为周边角膜时，NaOH的浓度越高，CNV的面积越大，而角膜溃疡的面积反而越小。这一相关性也证实了CNV与角膜溃疡面积呈相反趋势(P<0.05，r=-0.395 1)(图2)。

表2 碱烧伤后第14天各组CNV面积与角膜溃疡面积比较/(n=20，cm2)

图2 CNV的面积与角膜溃疡面积的相关趋势图

3 讨论

建立CNV模型的方法很多，包括烧灼法、角膜缝合法、角膜基质生长因子注射法[7-9]等。本研究通过不同浓度的NaOH作用于不同的角膜位置来诱导CNV形成，通过对CNV模型的成功率及角膜形态学的分析，评价模型的碱烧伤诱导效果。本研究表明，应用2 mol/L的NaOH且其烧灼位置为周边角膜是诱导CNV形成的最佳方法，但其作用的潜在机制尚不清楚，考虑角膜缘可能在这过程中发挥了重要作用。角膜缘作为结膜与角膜之间的屏障，避免了结膜新生血管侵入角膜[10-14]。在本研究中，烧灼位置为周边角膜的模型角膜缘损伤更严重，角膜的生理功能受到影响，从而导致角膜的生理功能受到损害，进而对模型的干扰更大。本研究还显示CNV的面积与NaOH的浓度呈正相关，这与以往研究[15]结果一致。

本研究还表明CNV面积与溃疡的面积呈负相关。Kim等[16]发现，诱导CNV形成可以使炎症因子浸润于角膜溃疡中，从而阻止角膜基质的溶解，这是治疗角膜溃疡的重要方法。本研究揭示的CNV与角膜溃疡的负相关关系为临床治疗化学烧伤引起的角膜溃疡提供了依据。基于此原理，临床上采用了一些方法，例如羊膜或球结膜覆盖等，通过诱导CNV形成来预防溃疡的发展。