基于生物信息学分析γ-谷氨酰基环转移酶基因表达在胃癌中的意义

余水红 钱 燕 王晓梅 龚 莉

1 安庆医药高等专科学校科研中心 安徽 安庆 246052；2 深圳大学医学院 广东 深圳 518061；3 安庆师范大学生命科学学院 安徽 安庆 246502

胃癌(gastric cancer，GC)是世界范围内发病率排名第五、死亡率排名第三的癌症，中国2018年约有39万GC新发病例和37万死亡病例[1]，5年生存率仅为15%～20%，转移性患者的中位生存期只有1年左右[1]。早期手术可以作为一种有效治疗GC的手段，但很多患者是在晚期才被确诊。因此，提高GC患者的诊断、治疗和预后，需要寻找新的治疗靶点和预后标志物。

γ-谷氨酰基环转移酶(γ-Glutamylcyclotransferase，GGCT)是参与谷胱甘肽代谢的主要酶之一，是一个由188个氨基酸组成的小分子蛋白质，GGCT参与多种癌症的发生发展过程。GGCT在人脑胶质瘤组织及细胞中表达均升高，其通过促进Notch受体表达，激活Akt信号通路，促进胶质瘤细胞的增殖[2]。GGCT在侵袭性食管鳞癌和高级别上皮内瘤变中的异常表达(分别为87.5%和85.0%)相对在低级别上皮内瘤变中表达(17.5%)更加明显，其可作为诊断高级别上皮内瘤变到上皮下浸润的食管癌的生物标志物[3]。敲除GGCT基因抑制了卵巢癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭，可作为患者治疗的预后标志物和潜在靶点[4]。GGCT与乳腺癌、骨肉瘤患者生存率相关，可作为癌症诊断或预后的生物标志物[5-6]。

本研究借助多个在线肿瘤数据库分析GGCT基因的表达及其与患者预后的关联，同时多方位评估了其相关的基因网络，并探讨其在肿瘤免疫中的作用，为GGCT作为GC诊断、治疗靶点及预后的基因标志物提供参考。

1 材料与方法

1.1 数据库 本研究应用数据库分别为UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu)，Oncomine数据库(https://www. oncomine.org/)，Kaplan-Meier plotter 数据库(http://kmplot.com/analysis)，LinkedOmics 数据库(http://www.linkedomics.org/login.php)，webgestalt数据库(http://www.webgestalt.org/)，TIMER数据库(https://cistrome.shinyapps. io/ timer/)。

1.2 方法

1.2.1 UALCAN数据库分析GGCT基因mRNA表达水平 UALCAN数据库基于TCGA数据库数据提供癌组织与癌旁组织中基因表达、生存分析、相关性分析和DNA启动子区甲基化数据分析[7]。本研究应用该数据库分析GGCT基因在GC组织与癌旁组织中mRNA的表达差异。

1.2.2 Oncomine数据库分析GGCT基因DNA拷贝数水平 Oncomine数据库是一个分析19种癌组织与癌旁组织中差异性表达癌基因、共表达基因以及基因表达与患者预后关系等的癌症微阵列数据库和整合数据挖掘平台[7]。本研究应用该数据库分析GGCT基因在GC组织与癌旁组织中DNA拷贝数差异。

1.2.3 Kaplan-Meier plotter数据库分析GGCT基因与患者预后的关系 Kaplan-Meier plotter数据库可以将CEO、EGA、TCGA数据库中常见癌症的mRNA的表达和预后数据进行整合。本研究依据GGCT基因不同分位数表达将患者分为高表达组及低表达组，并进行生存分析。

1.2.4 Linked Omics数据库分析GGCT基因及共表达基因网络 Linked Omics数据库可用于分析32个TCGA癌症相关的多维数据集。本研究通过该数据库用Pearson相关系数对GGCT基因的共表达基因进行分析，并在火山图和热图中显示结果。

1.2.5 webgestalt数据库对GGCT基因正负相关基因进行功能注释及KEGG通路分析 webgestalt是一个专注于基因功能富集，蛋白质相互作用，miRNA靶基因及药物靶点等各种注释信息的在线网站。本研究应用该数据库对与GGCT基因成正负相关的100个基因进行功能注释及KEGG通路分析，初步了解其在GC中的作用机制。

1.2.6 TIMER数据库分析GGCT基因与免疫细胞的关系 TIMER数据库可用于分析来自TCGA数据库中的32种癌症类型的免疫细胞浸润。本研究应用该数据库分析GGCT基因在GC中的表达与免疫细胞(包括B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞)浸润的相关性。

1.2.7 统计学方法 实验数据来自以上数据库，采用系统默认的统计学方法，计算危险比(hazard radio，HR)及其95%置信区间(confidence interval，CI)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GGCT基因在GC组织中的表达 异常表达的基因是诊断肿瘤发病的潜在重要分子指标。本研究借助Oncomine和UALCAN数据库初步评估了GGCT在GC组织及癌旁组织中的转录水平。Oncomine数据库数据显示GGCT mRNA表达量排在前1%以内，与癌旁组织相比，GGCT的mRNA表达量和DNA拷贝数谱在肿瘤组织中显著升高，P<0.05(图1)。UALCAN数据库分析了多种临床病理特征中GGCT的转录水平，如样本类型、性别、年龄、患者、种族、癌症分期、肿瘤分级、幽门螺杆菌感染和组织学亚型，结果表明，GGCT mRNA表达水平均高于正常对照组，P<0.05(图2)。因此，GGCT可作为诊断GC的潜在指标。

图1 GGCT在GC组织和癌旁组织中的转录水平(Oncomine数据库)

A.样本类型；B.性别；C.年龄；D.患者；E.种族；F.个体癌症分期；G.肿瘤分级；H.幽门螺杆菌感染状态；I.组织学亚组。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.2 GGCT与GC患者预后的相关性 肿瘤患者预后是评估基因重要性的指标之一。本研究利用Kaplan-Meier plotter 数据库评估GGCT基因表达与GC患者预后的相关性，结果表明，GGCT高表达组的总生存期(overall survival，OS)、首次进展期(first progression，FP)及进展期(post progression survival，PPS)均明显长于低表达组(HR<1，P<0.01)(图3)。因此，GGCT可作为判断肿瘤患者预后的候选基因。

注：OS.总生存期；FP.首次进展期；PPS.进展期。

2.3 GGCT与不同临床病理特征GC患者预后的相关性 本研究借助Kaplan-Meier plotter数据库进一步挖掘GGCT基因与多种临床病理特征GC患者预后的相关性，如不同的治疗方法、人表皮生长因子受体2(HER2)的状态、分化、Lauren分型及临床分期。结果表明，GGCT的高表达提高了单纯手术治疗患者，HER2阴性和HER2阳性患者，II/ III/IV期患者的生存总期(HR<1，P<0.01)，而在5-FU为基础的辅助治疗及低分化患者的生存总期较差(HR>1，P<0.01)，同时GGCT表达与其他辅助治疗，中分化和高分化，GCI期患者的总生存率无显著相关性(表1～3，图4)。

表1 GGCT表达与GC患者治疗的关系

表2 GGCT表达与GC人表皮生长因子受体2的关系

表3 GGCT表达与GC分化的关系

A. I期；B. II期；C. III期；D. IV期。

2.4 GGCT基因在GC中的共表达网络 GGCT基因潜在功能的发挥可能是与多种基因共同作用的结果。本研究利用Linked Omics功能模块检测GGCT基因在GC中的共表达模块，火山图显示有5 020个基因(红点)与GGCT表达呈显著正相关(FDR<0.01)，如基因LSM5(r=0.745，P<0.001)，CBX3r=0.702，P<0.001)，CYCS(r=0.672，P<0.001)； 6 458个基因(黑点)与GGCT表达呈显著负相关(FDR<0.01)，如基因ZFYVE1(r=-0.629，P<0.001)，ZBTB4(r=-0.608，P<0.001)，MEF2D(r=-0.605，P<0.001)(图5A)。正负相关的前50个关键基因热图见图5B～C。本研究利用MetaScape 数据库对这100个基因进行功能注释及KEGG通路分析，结果表明，这些正相关基因参与的生物学过程包括生物调节、刺激反应、代谢过程等13类过程，细胞组分主要集中在细胞膜、细胞核、膜封闭腔等19类，而分子功能包括蛋白结合、核酸结、离子束缚合等13类(图6)。负相关基因参与的生物学过程包括代谢过程、细胞骨架组成、生物调节等13类过程，细胞组分主要集中在膜封闭腔、蛋白质复合物、细胞核等15类，而分子功能包括蛋白结合、核酸结、离子束缚合等13类(图7)。通路分析结果表明，GGCT基因正相关基因参与了cGMP-PKG信号通路、肌肉收缩、Apelin信号通路和一氧化氮激活鸟苷酸环化酶等过程(表4)，而负相关基因参与了DNA复制、染色体维护、细胞周期和DNA合成等过程(表5)。富集分析有助于了解GGCT及其相互作用基因在GC中的作用机理。

A. 火山图；B. 正相关的前50个关键基因热图；C. 负相关的前50个关键基因热图。

图6 GGCT基因和负相关基因的GO功能注释(MetaScape数据库)

图7 GGCT基因和负相关基因的GO功能注释(MetaScape数据库)

表4 GGCT基因及正相关基因KEGG通路富集(MetaScape数据库)

表5 GGCT基因及负相关基因KEGG通路富集(MetaScape数据库)

2.5 GGCT基因在GC组织中与免疫细胞的关系 肿瘤发展与免疫细胞相关，本研究利用TIMER数据库分析GGCT基因在GC免疫微环境中的表达，结果显示，GGCT 在GC免疫微环境中与不同发育阶段的CD8+T细胞呈负相关，与CD4+T细胞呈负相关，与CD4+记忆性T细胞及T效应细胞呈正相关，与B细胞呈负相关，与处于不同发育阶段的巨噬细胞有正负不同关系，与树突状细胞主要呈负相关，与中性粒细胞主要无相关性(图8)。

图8 GGCT基因与肿瘤免疫细胞间的相关性(TIMER数据库)

3 讨论

GGCT是一种参与细胞形态变异、衰老、自噬、上皮-间充质转化和细胞内信号通路的重要酶。敲除GGCT基因可显著诱导胶质母细胞瘤、乳腺癌、宫颈癌和前列腺癌细胞衰老[8]。在乳腺癌和前列腺癌中，自噬在GGCT缺失所产生的生长抑制中发挥了重要作用[9]。有两组神经胶质瘤细胞系在GGCT敲除后改变了细胞内信号通路[8]。GGCT可能在癌症的发生发展中发挥着多重作用，其有望成为GC治疗潜在的分子靶点来源。为能够详细了解GGCT在GC中的潜在功能及其基因调控网络，本研究利用多个成熟的在线公共数据库对其进行生物信息学分析，以期为GGCT基因在GC治疗中的进一步研究提供参考。

转录分析表明GGCT mRNA水平及DNA 拷贝数明显高于正常的GC组织[10]，研究表明GGCT在GC组织中转录水平与本文研究一致，然而GGCT高表达组GC患者OS、 FP及 PPS均明显长于低表达组患者，同时GGCT高表达利于II/ III/IV期GC患者生存总期。或许随着GC发生过程GGCT表达量升高，而随着肿瘤进展表达量逐渐降低，因此GGCT作为GC诊断基因和预后标记基因值得进一步基础及临床研究。

GGCT与不同临床病理特征GC患者预后的相关性分析表明，GGCT高表达提高单纯手术治疗GC患者生存期，而降低5-FU为基础的辅助治疗患者生存期。谷胱甘肽S转移酶P1(GSTP1)催化Ⅰ相酶代谢的亲电子基团(包括多种化疗药物)与谷胱甘肽结合，使其成为水溶性物质而排出体外，消除5-FU化疗药物的细胞毒性[10]，而GGCT基因介导谷胱甘肽的合成与分解，从而影响5-FU的疗效。推测患者生存期缩短与化疗药物5-FU个体化治疗有关，因此GGCT表达是否可以作为个体化治疗基因标志物预测5-FU治疗GC患者效果需进一步研究。

对GGCT基因共表达网络分析表明，GGCT及共表达网络基因参与了细胞周期阶段、cGMP-PKG信号通路、肌肉收缩、跨膜损伤运输、Apelin信号通路和一氧化氮刺激鸟苷酸环化酶等过程，这些发现部分与GC治疗基础研究的分子途径基本一致[11]，但cGMP-PKG及Apelin信号通路是如何影响GC发生发展需要基础研究深入探索。

肿瘤微环境是非癌细胞存在于肿瘤内部或肿瘤周围外部环境，免疫细胞是肿瘤微环境重要组成部分，对基因的变异或选择性表达具有重要的影响作用[12]，本研究表明GGCT与不同发育阶段的CD8+T细胞、CD4+T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞及中性粒细胞的浸润相关性有所不同，可能在抗肿瘤免疫或免疫逃逸过程中起着不同作用，GGCT是否可以介导细胞免疫治疗还需进一步探讨。

综上所述，本研究通过生物信息分析从多个层次探讨GGCT的重要性及其作为GC预后潜在标志物。分析结果表明GGCT在GC中的上调可能在转录合成、代谢过程、生物调控、跨膜损伤运输和细胞周期的多个步骤中具有较大的影响。此外，GGCT基因在免疫调节和免疫治疗中也具有重要作用，这些发现需要更多的GC基因组学研究和后续的功能研究。