秀珍菇多酚提取工艺优化及抗氧化活性探究

杨斌，宋厚辑，郑峻，夏俊慧，李佳欢,2，兰世步，孙淑静,2，胡开辉,2*，金文松,2*

(1.福建农林大学 生命科学学院，福州 350002；2.福建农林大学(古田)菌业研究院，福建 宁德 352200；3.福建省食用菌技术推广总站，福州 350003；4.罗源县食用菌研发中心，福州 350600)

秀珍菇(Pleurotusgeesteranus)，又名小平菇，伞菌目、侧耳科、侧耳属大型真菌。秀珍菇子实体味道鲜美、营养丰富，有“菇中极品”的美称[1]。此外相关研究表明，秀珍菇子实体多糖具有抗氧化[2-3]、抗炎症[4]、抗肿瘤[5]、抗衰老[6]等多种生物功能，在食品、保健、医药等领域具有较高的应用价值。

多酚是植物和大型真菌生长发育过程中一类重要的次生代谢产物，因其具有多个酚羟基结构，可快速捕捉周围环境中的自由电子，具有强抗氧化性，是一类天然的抗氧化剂[7-8]，在医药领域具有重要的应用价值。此外，多酚类物质还具有抑菌活性，可运用于食品保鲜和防腐，拥有开发成天然防腐剂的潜力[9-11]，因而受到了研究人员的广泛关注。目前关于真姬菇[12-13]、香菇[14]、牛肝菌[15-16]等常见食用菌多酚提取工艺和生物活性的研究已有报道，但是关于秀珍菇多酚的功能研究国内外还鲜见报道，这在一定程度上限制了秀珍菇功能性保健食品和调味品的开发和应用。因而，本研究选择秀珍菇干品作为实验材料，采用超声辅助水提法对秀珍菇多酚进行提取，并对提取工艺进行优化，此外，还对秀珍菇多酚的体外抗氧化活性和自由基清除能力进行探究，以期为提升秀珍菇的综合利用价值奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

秀珍菇干品：购于福建省古田县食用菌市场；无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、十二水合磷酸钠、福林酚、碳酸钠、钼酸铵：均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；1-1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2，2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、维生素C：均购于美国Sigma公司；没食子酸：购于上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

FS1000Y-1不锈钢高速粉碎机 广州雷迈机械设备有限公司；BILON22-500D超声波清洗机 上海比朗仪器制备有限公司；QL-866型旋涡振荡器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；3020型多功能酶标仪 赛默飞世尔科技有限公司；3K15型高速冷冻离心机 美国Sigma公司；DK-8B型电热恒温水浴槽 上海精宏实验设备有限公司；FA2004B型电子天平、UV765型紫外可见光分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 原材料预处理

应用粉碎机将秀珍菇干品粉碎，过60目筛，制成样品备用。

1.3.2 多酚含量测定

参照张梅梅等[17]的测定方法，以没食子酸质量浓度为横坐标，以对应的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线(见图1)，所得线性方程为y=10.088x+0.0261，R2=0.9981。在750 nm处分别测定各实验条件制备的多酚水溶液吸光值，按照式(1)计算多酚得率。

图1 多酚含量测定标准曲线Fig.1 The standard curve for determination of polyphenols

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式中：C为标准曲线计算所得的多酚浓度(mg/mL)； V为提取液总体积(mL)；m为干粉质量(g)；D为稀释倍数。

1.3.3 秀珍菇多酚提取单因素实验

称取秀珍菇粉末1 g，以水作为提取溶剂，单因素设计分析温度(35，40，45，50，55，60 ℃)、时间(30，60，90，120，150 min)、超声功率(200，250，300，350，400 W)、液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1，mL/g)对秀珍菇多酚提取得率的影响。

1.3.4 响应面工艺优化

基于单因素实验结果，分别选择4个因素(温度、时间、功率、液料比)适合进一步优化的区域值，设计因素水平编码(见表1)，以多酚得率为响应值，利用Design-Expert 8.0.6软件设计29组实验，对秀珍菇多酚提取工艺进行优化。

表1 Box-Behnken设计因素水平编码Table 1 The factors and levels of Box-Behnken design

1.3.5 抗氧化活性测定

1.3.5.1 总抗氧化能力测定

参考梁引库等[18]的测定方法，待反应结束后，取200 μL的反应液置于96孔板中，于695 nm处测量吸光度，以去离子水作空白对照，维生素C作阳性对照，每个浓度设3个平行，取平均值。

1.3.5.2 DPPH自由基清除能力测定

参考Ma等[19]的测定方法，待反应结束后，取200 μL反应液至96孔板中，于515 nm处测得样品吸光度(As)，以水作空白对照测得空白吸光度(Ac)，用无水乙醇代替DPPH溶液测得样品本底吸光度(Aj)，每个浓度设3个平行，用维生素C作阳性对照，按照式(2)计算DPPH自由基清除率。

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1.3.5.3 ABTS自由基清除能力测定

参考Re等[20]的测定方法，待反应结束后，取200 μL反应液至96孔板中，于734 nm处测得样品吸光度(As)，以水代替样品作为空白对照测得空白吸光度(Ac)，以无水乙醇代替ABTS工作液测得样品本底吸光度(Aj)，每个浓度设3个平行，以维生素C作为阳性对照，按照式(3)计算ABTS自由基清除率。

(3)

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 不同溶剂对多酚得率的影响

在本实验中，首先探究提取溶剂是否会对多酚得率产生影响。由图2可知，以水作为提取溶剂，多酚得率最高，随着溶剂极性的减小，多酚得率逐渐降低，表明秀珍菇多酚极性较大，易溶于水，因而后续实验选择以水作为提取溶剂。

图2 溶剂对多酚得率的影响Fig.2 Effects of the solvents on the yield of polyphenols

2.1.2 不同提取温度对多酚得率的影响

以水作为提取溶剂的基础上，本研究进一步分析温度对多酚提取得率的影响，实验结果见图3。

由图3可知，在30～55 ℃温度范围内，温度对多酚提取得率的影响不大，但在45 ℃时，多酚得率达到最大值(7.52 mg/g)，可能在该温度范围内易使细胞壁软化，改变细胞膜的通透性，促进胞内物质溶出。但温度达到60 ℃时，多酚得率明显下降，可能是因为多酚类物质属于热敏物质，温度过高会导致酚类物质被分解，从而降低多酚的提取得率。因此，秀珍菇多酚的最适提取温度为45 ℃。

图3 提取温度对多酚得率的影响Fig.3 Effects of the extraction temperature on the yield of polyphenols

2.1.3 不同提取时间对多酚得率的影响

本研究系统地分析了30～150 min的处理时间对秀珍菇多酚提取效果的影响，见图4。

图4 提取时间对多酚得率的影响Fig.4 Effects of the extraction time on the yield of polyphenols

由图4可知，当提取时间为90 min时，多酚得率达到最大值(8.2 mg/g)。实验结果表明测定的多酚含量取决于提取时间，当胞内多酚逐渐溶出直至胞外浓度趋于饱和时，得率逐渐上升；由于多酚在高温下的不稳定性，多酚可能以一定的速率进行降解，当多酚溶出速率与降解速率持平时，即可获得理论上的最大多酚得率。本组单因素实验结果表明最适提取时间为90 min。

2.1.4 不同超声功率对多酚得率的影响

超声波是一种弹性波，其振动可以产生巨大的能量，在提取过程中加以超声处理可以加速细胞壁的破裂，促进胞内物质溶出，可有效提高提取的效率。

由图5可知，多酚得率随着超声功率的增加整体呈先上升后下降的趋势，当超声功率为300 W时，多酚得率达到最大值(6.45 mg/g)；进一步加大超声功率，多酚得率大幅下降，推测原因可能为大额功率超声时产生大量热量，破坏了多酚结构。

图5 超声功率对多酚得率的影响Fig.5 Effects of the ultrasonic power on the yield of polyphenols

2.1.5 不同液料比对多酚得率的影响

不同液料比对多酚得率的影响见图6。

图6 液料比对多酚得率的影响Fig.6 Effects of liquid-solid ratio on the yield of polyphenols

由图6可知，液料比在20∶1～70∶1(mL/g)范围内时，多酚得率随着液料比的增加而逐渐增加，当液料比为70∶1(mL/g)时，多酚得率最高，继续增加液料比，多酚得率缓慢下降。实验结果表明样品量不变时，增加提取溶剂的体积，多酚得率增加，究其原因可能为样品与溶剂接触的表面积增大；继续增加液料比，胞内胞外多酚浓度逐渐趋于一致，此时多酚得率逐渐趋于稳定或略有下降。

2.2 响应面实验法优化提取工艺条件

2.2.1 回归方程建立

根据单因素实验结果，以温度、时间、超声功率和液料比为自变量，多酚得率为因变量，对超声水提秀珍菇的工艺进行优化，Box-Behnken设计与结果见表2。利用Design-Expert 8.0.6软件对所得数据进行分析和拟合，得到二次回归方程：

表2 Box-Behnken设计及实验结果

Y=17.32-0.51A-0.48B-0.46C-0.37D-0.48AB+0.53AC+0.91AD+0.44BC-1.05BD+0.39CD-1.49A2-1.03B2-2.18C2-1.28D2。

2.2.2 模型方差分析

模型方差分析结果见表3，模型的F值=24.2，(Prob>F)<0.0001，表明所构建的模型极显著，实验设计合理且具有统计学意义；失拟项的(Prob>F)>0.05，不显著，相关系数R2=0.963，RAdj2=0.9232，表明所建模型可用于预测秀珍菇水提多酚的实际得率，预测值与实验值的拟合程度高，92.32%的秀珍菇多酚得率可用此模型来预测；而变异系数C.V.(%)值仅为2.87，表明在实验过程中精确度高，实验结果可靠。

表3 回归方程方差分析结果Table 3 The variance analysis results of regression equations

2.2.3 多酚提取响应面分析

由表3可知，温度与功率两因素间的交互作用对多酚提取得率的影响达到显著水平(P<0.05)，液料比与温度、时间两因素间的交互作用均达到极显著水平(P<0.01)。为较为直观地观察因素变化对多酚提取得率变化的影响，根据2.2.1所拟合出的回归方程，利用Design Expert 8.0.6软件绘制出的3D曲面图见图7～图9。

功率275～300 W、时间66～90 min时，多酚得率较高(见图7中a)。功率275～300 W、温度42～46 ℃时，多酚得率较高(见图7中b)。液料比60～70(mL/g)、功率275～300 W时，多酚得率较高(见图8中a)。液料比65～75(mL/g)、时间84～102 min时，多酚得率较高(见图8中b)。液料比60～70(mL/g)、温度40～46 ℃时，多酚得率较高(见图9中a)。时间78～102 min、42～46 ℃时，多酚得率较高(见图9中b)。分析等高线图可知，所有的图形均呈现椭圆形(见图7～图9)，表明分析因素间的交互作用对多酚提取具有一定的影响，其中温度与液料比间的交互作用对多酚提取得率的影响最大，见图9中a。

图7 功率和时间(a)、功率和温度(b)之间的交互作用对多酚得率的影响Fig.7 Effects of the interaction between power and time (a), power and temperature (b) on the yield of polyphenols

图8 液料比和功率(a)、液料比和时间(b)之间的交互作用对多酚得率的影响Fig.8 Effects of the interaction between liquid-solid ratio and power (a), liquid-solid ratio and time (b) on the yield of polyphenols

图9 液料比和温度(a)、时间和温度(b)之间的交互作用对多酚得率的影响Fig.9 Effects of the interaction between liquid-solid ratio and temperature (a), time and temperature (b) on the yield of polyphenols

2.2.4 响应面分析最优条件实验验证

利用Design-Expert 8.0.6对响应面实验数据进行分析，得出秀珍菇多酚提取的最佳工艺为：液料比67.83∶1(mL/g)，291.7 W，43.75 ℃，提取86.98 min，多酚理论得率为17.486 mg/g。在此基础上，结合实验室的实际条件，将所得工艺稍作调整：液料比68∶1(mL/g)，300 W，45 ℃，提取87 min，多酚实际得率为(17.428±0.121)mg/g，与理论得率较为接近，表明所建模型能较好地对秀珍菇多酚的实际得率进行预测，拟合程度高。

2.3 多酚提取物体外抗氧化活性分析

2.3.1 总抗氧化能力分析

采用钼酸铵法对秀珍菇多酚进行了总抗氧化能力测定，以维生素C作为阳性对照，实验结果见图10。

图10 多酚提取物(a)和维生素C(b)总抗氧化活性分析Fig.10 The total antioxidant activity analysis of polyphenol extracts (a) and Vc (b)

由图10可知，在0.04～0.2 mg/mL浓度范围内，多酚提取物和维生素C的总抗氧化能力与浓度呈现正相关性，根据断点实验数据，进行线性方程回归，并分别计算多酚提取物与对照的EC50值。经计算，秀珍菇多酚提取物的EC50=0.177 mg/mL，维生素C的EC50=0.094 mg/mL，表明秀珍菇多酚提取物的总抗氧化能力弱于阳性对照。

2.3.2 DPPH自由基清除能力分析

应用DPPH自由基清除法对秀珍菇多酚体外自由基清除能力进行了测定，以维生素C作为阳性对照，结果见图11。

图11 多酚提取物(a)和维生素C(b)DPPH自由基清除能力分析Fig.11 DPPH radical scavenging capacity analysis of polyphenol extracts (a) and Vc (b)

由图11可知，在0.04～0.2 mg/mL浓度范围内，多酚提取物和维生素C的DPPH自由基清除率与浓度呈现出良好的线性关系，根据拟合得出的线性方程分别计算出多酚提取物和维生素C的IC50值，其中多酚提取物的IC50=0.363 mg/mL，维生素C的IC50=0.110 mg/mL，结果表明秀珍菇多酚对DPPH自由基具有一定清除能力，约为阳性对照清除DPPH自由基能力的30%。

2.3.3 ABTS自由基清除能力分析

采用ABTS自由基清除法对秀珍菇多酚体外自由基清除能力进行了测定，以维生素C作为阳性对照，结果见图12。

图12 多酚提取物(a)和维生素C(b)对ABTS自由基清除能力分析Fig.12 ABTS radical scavenging capacity analysis of polyphenol extracts (a) and Vc (b)

由图12可知，在0.004～0.02 mg/mL浓度范围内，多酚提取物清除ABTS自由基的IC50值达0.008 mg/mL，阳性对照清除ABTS自由基的IC50值达0.005 mg/mL。实验结果显示秀珍菇多酚清除ABTS自由基能力约为维生素C清除ABTS自由基能力的62.5%，表明秀珍菇多酚拥有较强的清除ABTS自由基能力。

3 结论

本文应用响应面设计法对超声水提秀珍菇多酚工艺进行了优化，最优提取工艺为：液料比68∶1(mL/g)，300 W，45 ℃，提取87 min，多酚得率为(17.428±0.121)mg/g；同时对秀珍菇多酚体外抗氧化活性和自由基清除能力进行了测定，结果表明秀珍菇多酚具有较强的抗氧化活性和自由基清除能力。以上研究结果为秀珍菇多酚在食品保鲜行业的应用奠定了一定基础，同时也为秀珍菇功能食品和调味品的开发应用提供了一定的理论依据。