切除修复交叉互补基因家族成员在乳腺癌中的表达及其对预后评估的价值研究

张倩，侯俊宸，王丹丹，张鹤达，唐金海，张建

乳腺癌是发病率最高的恶性肿瘤之一，是全球女性癌症死亡的第二大原因，据美国癌症协会估计，2021年美国将有281 550例新发乳腺癌患者和43 600例乳腺癌死亡患者[1]。尽管近年来乳腺癌的治疗有了显著进展，但其预后仍不尽如人意。在这种情况下，寻找新的早期诊断标志物以及治疗靶点对改善乳腺癌患者的预后具有重要的临床价值。切除修复交叉互补(excision repair cross complementary，ERCC)基因家族由9个基因组成(包括ERCC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ERCC6、ERCC6L、ERCC6L2、ERCC8)，编码参与复杂DNA修复机制的蛋白，负责清除DNA损伤并维持染色体的稳定性[2]。ERCC基因被认为是维持DNA修复能力的重要因素，是核苷酸切除修复通路的关键元件[3-6]。有研究表明ERCC基因家族成员在乳腺癌、骨肉瘤及肺癌中起重要作用[7-11]。然而，ERCC家族成员在乳腺癌患者中的表达及其对预后的作用机制尚不明确。本研究通过挖掘在线数据库，分析ERCC家族成员在乳腺癌患者中的表达及对预后评估的价值，为发现新的生物标志物和开发更有效的乳腺癌治疗药物靶点提供证据。

1 资料与方法

1.1 收集ERCC基因家族在TCGA中的mRNA表达数据 肿瘤基因组图谱(TCGA)计划是由美国国家癌症研究所(National Cancer Institute，NCI)和美国国家人类基因组研究所(National Human Genome Research Institute，NHGRI)于2006年联合启动的项目。该计划研究的癌症类型共有39种，涉及29种癌症器官，1万多个肿瘤样本，27万多份文件，其中包括1 098例乳腺癌。本研究收集的临床参数包括性别、年龄、肿瘤(T)阶段、淋巴结(N)分期、转移(M)分期。本研究使用TCGA推荐的基因组数据共享(Genomic Data Commons,GDC)传输工具下载了ERCC家族的高通量测序(high-throughput sequencing,HTSeq)及每千个碱基的转录每百万映射读取的片段数(Fragments Per Kilobase of transcript Per Million mapped reads，FPKM)数据。

1.2 分析ERCC基因家族成员在乳腺癌组织及正常乳腺组织中的mRNA表达差异 利用Perl 5.26软件从HTSeq表达数据中获取ERCC家族的mRNA表达水平。利用R3.6.0软件中的limma软件包分析ERCC家族在乳腺癌组织与乳腺癌癌旁组织中的表达差异。通过corrplot软件包计算ERCC基因家族成员之间的相关性。使用pheatmap软件包对结果进行可视化。

1.3 分析ERCC基因家族成员对乳腺癌患者生存预后的预测价值 ①采用单因素Cox比例风险回归评估ERCC基因家族成员(ERCC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ERCC6、ERCC6L、ERCC6L2、ERCC8)及各临床参数与乳腺癌患者总生存期(OS)、无进展生存期(PFS)、疾病特异性生存期(DSS)和无疾病生存期(DFS)的相关性。②采用多因素Cox比例风险回归分析ERCC基因家族成员(ERCC1、ERCC5、ERCC6L)对乳腺癌患者OS的预测价值。分析采用R3.6.0软件的survival软件包进行，相关的森林图用ggplot2包绘制。

1.4 分析ERCC基因家族成员与肿瘤免疫浸润细胞(TIIC)的相关性 使用在线工具肿瘤免疫评估资源数据库(TIMER)平台(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)计算TIMER中ERCC基因家族成员表达水平和乳腺癌中免疫细胞浸润水平的系数，确定乳腺癌中ERCC基因家族成员的表达是否与免疫浸润水平相关。

1.5 基因集合富集分析(GSEA)利用GSEA 4.0.1软件(http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)鉴定ERCC基因家族成员(ERCC1、ERCC6L)差异表达的相关通路，以研究ERCC1和ERCC6L差异表达影响乳腺癌发生的潜在生物学机制。

2 结果

2.1 ERCC基因成员在乳腺癌组织中的表达情况

共获取到来自TCGA数据库中的1 109个乳腺癌样本和113个乳腺癌癌旁组织样本的9个ERCC成员(ERCC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ERCC6、ERCC6L、ERCC6L2、ERCC8)的mRNA表达数据。ERCC1的表达与ERCC2的表达呈显著负相关，ERCC1的表达与ERCC4、ERCC6L2的表达呈显著正相关，ERCC6的表达与ERCC6L2的表达呈显著负相关(图1、图2)。相较于癌旁组织，乳腺癌组织中ERCC6L2、ERCC5、ERCC8表达下调，ERCC1、ERCC2、ERCC6L表达上调。ERCC3、ERCC4、ERCC6在乳腺癌与癌旁组织中的表达差异无统计学意义(图3)。

图1 ERCC基因家族成员表达之间的相关性

图2 乳腺癌中ERCC基因家族成员表达谱热图

图3 ERCC基因家族成员在乳腺癌与癌旁组织中的表达水平差异

2.2 ERCC基因家族成员在乳腺癌预后评估中的价值 单因素Cox比例风险回归分析结果显示，高表达的3个ERCC成员(ERCC1、ERCC5和ERCC6L)和2个临床特征(年龄、分期)与乳腺癌患者不良预后相关[ERCC1的风险比(HR):0.944(0.899～0.990)；ERCC5的HR:0.847(0.745～0.962)；ERCC6L的HR:1.116(1.007～1.238)，见表1]。

表1 单因素Cox比例风险回归分析乳腺癌预后的影响因素

TCGA数据库中乳腺癌患者的表达谱和临床数据显示，ERCC1高表达与乳腺癌患者的OS和DSS呈负相关(P<0.05)，ERCC5高表达仅与患者的OS呈负相关(P=0.002)，ERCC6L高表达与患者的OS、PFS、DSS、DFS均呈负相关(P<0.05，图4～7)。多变量Cox比例风险回归分析结果显示，ERCC1和ERCC6L的高表达以及2个临床特征(高龄和较晚的分期)是乳腺癌不良预后的独立危险因素(图8)。

图4 ERCC基因家族成员表达差异对乳腺癌患者总生存期影响

图5 ERCC基因家族成员表达差异对乳腺癌患者无进展生存期影响

图6 ERCC基因家族成员表达差异对乳腺癌患者特异性生存期影响

图7 ERCC基因家族成员表达差异对乳腺癌患者无病生存期的影响

2.3 TIIC与ERCC基因家族成员之间的相关性 ERCC1的表达水平与B细胞浸润水平(r=-0.109，P<0.001)、CD8+T细胞浸润水平(r=-0.154，P<0.001)、中性粒细胞浸润水平(r=-0.086，P<0.05)、树突状细胞浸润水平(r=-0.083，P<0.05)呈负相关，与CD4+T细胞浸润水平(r=-0.154，P<0.001)呈正相关。ERCC6L的表达水平与肿瘤纯度(r=0.141，P<0.001)、B细胞浸润水平(r=0.226，P<0.001)、CD8+T细胞浸润水平(r=0.162，P<0.001)、中性粒细胞浸润水平(r=0.195，P<0.001)、树突状细胞浸润水平(r=0.169，P<0.001)呈正相关。余ERCC基因家族成员表达量与免疫细胞、肿瘤纯度的相关性无统计学意义，见图9。

图9 ERCC基因家族成员表达量与免疫细胞、肿瘤纯度的相关性

2.4 ERCC基因家族成员在乳腺癌预后中的潜在作用机制 GSEA分析结果显示，ERCC1高表达与“核糖体”“系统性红斑狼疮”有关；ERCC6L高表达与“泛素介导的蛋白质水解”“剪接体”、“卵母细胞减数分裂”“嘧啶代谢”“卵母细胞减数分裂”“基底切除修复”“细胞周期”有关，见图10。

图10 基于GSEA与ERCC1、ERCC6L表达相关的KEGG富集分析

3 讨论

生物信息学是一门对生物信息进行收集、处理、存储、传播、分析和解释的学科[12]。生物信息学分析已被用于探索多种癌症的致癌机制[13-15]。ERCC基因家族成员的过表达已在多种肿瘤研究文献中报道，且有证据表明ERCC基因家族成员在多种肿瘤的发生和预后中发挥重要作用[8,16-18]。本研究分析乳腺癌组织中表达的9种ERCC基因成员之间的相关性，并与正常乳腺组织相比，发现大多数ERCC成员(ERCC1、ERCC2、ERCC5、ERCC6L、ERCC6L2)在乳腺癌细胞中呈高表达，但仅ERCC1、ERCC2、ERCC6L高表达与乳腺癌患者的OS相关，仅ERCC6L高表达与乳腺癌患者的PFS相关。

DNA修复对维持遗传的稳定性至关重要，其主要经过4种途径进行修复，包括碱基切除修复、错配修复、核苷酸切除修复和双链断裂修复[19]。ERCC基因家族成员是影响核苷酸切除修复的重要因素[6]。ERCC1位于19q13.2，是核苷酸切除修复途径的限速酶，能够修复化学药物引起的DNA损伤，在核酸损伤修复过程和细胞凋亡过程中起重要作用[20]。据报道，ERCC1可能是癌症治疗中克服化疗耐药性的一个新的治疗靶点[21]，但ERCC1在乳腺癌中的表达及对预后的影响尚无研究报道。本研究发现，在TCGA数据库中，ERCC1在乳腺癌组织中的表达高于癌旁正常组织，ERCC1表达的增加与较差的OS及DSS显著相关。ERCC1的表达水平与B细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞及树突状细胞的浸润水平呈负相关，单因素和多因素Cox回归分析均证实了ERCC1在预测乳腺癌患者不良预后方面的价值，故推测高表达的ERCC1通过某种机制降低了肿瘤中免疫细胞的含量，增加了乳腺癌细胞的免疫逃逸，从而促进了肿瘤的增殖，提示今后靶向ERCC1的免疫治疗策略成为可能。

A：ERCC1；B：ERCC5；C：ERCC6L图8 多变量Cox回归分析乳腺癌预后的影响因素(*P<0.05，**P<0.01)

ERCC6L是从小鼠胚胎中成功克隆的新基因(GenBank接受号：AY172688)[22]。其在调节胚胎、大脑和其他组织的发育中发挥重要作用[23-25]。最近有研究在多种恶性实体肿瘤中检测到ERCC6L的异常表达，包括乳腺癌[26]、肾癌[27]及成神经细胞瘤[28]。此外，有研究发现抑制ERCC6L的表达可以抑制癌细胞的增殖，表明ERCC6L可能是一种有效的抑制肿瘤进展的生物标志物[27]。本研究发现ERCC6L在乳腺癌组织中的表达高于正常乳腺组织，且在ERCC6L高表达的乳腺癌组织中发现了多种癌症相关通路，而ERCC6L在乳腺癌中高表达预示着较差的OS、PFS、DSS及DFS。Cox回归分析证实高表达的ERCC6L可以导致乳腺癌较差的预后，并且与大多数类型的免疫细胞高浸润相关。故推测ERCC6L通过某种机制抑制免疫激活，调节免疫系统来降低对肿瘤的免疫反应，提示今后部分患者可从靶向ERCC6L的免疫治疗中获益。

综上所述，ERCC基因家族成员在乳腺癌组织中存在差异表达，并且与乳腺癌患者的临床分期、疾病进展及生存预后密切相关。但由于生物信息学分析的局限性，关于ERCC基因家族成员在乳腺癌中的功能以及相关的分子机制尚需进一步深入研究。