加味脉君安脂质体片剂的制备及体外同步释放研究

唐兰如，王俏，刘文锦，刘红，陈勇

(中药生物技术湖北省重点实验室，药物高通量筛选技术国家与地方联合工程研究中心，湖北 武汉 430062)

0 引言

脉君安片是由武汉中联药业集团股份有限公司生产的中药成方制剂，处方含有钩藤、氢氯噻嗪和葛根，具有平肝熄风、解肌止痛的功效，临床用于治疗高血压症、头痛眩晕、颈项强痛、失眠心悸、冠心病[1-2].因处方工艺设计方面的缺陷，脉君安片需要频繁服用且剂量大，患者依从性差，由此我们开发了服用剂量小、疗效显著、毒副作用小的浓缩型脉君安片，并获得国家发明专利授权[3]. 此外，长期使用脉君安片会激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)和花生四烯酸细胞色素P450羟化代谢途径，导致降压抵抗作用[4]. 中医认为肝肾心三脏阴阳虚实的消长失衡均可引发高血压病，且主要与肝脏有关，研究发现和厚朴酚能显著抑制大鼠肝脏CYP2E1及CYP4A活性，进而拮抗糖脂代谢紊乱状态下肝脏的氧化应激损伤[5]，厚朴总酚联合脉君安片可以调节RAAS，改善血管内皮功能，减轻内脏器官的氧化应激障碍，抑制CYP4A活性，从而抑制强缩血管物质羟基二十碳四烯酸的体内生成，改善降压抵抗现象[6].因此我们以浓缩型脉君安片为基础，增加了和厚朴酚，以期改善原方剂长期使用产生的降压抵抗，增强体内抗氧化应激及抗炎能力.

大豆苷元是葛根的主要活性成分，可以治疗冠心病和高血压等疾病，对心脑血管疾病具有防治作用[7-8]；钩藤碱是钩藤的主要有效成分，具有降血压、扩张血管、抗心律失常、抗动脉粥样硬化的药理作用[9].因此我们以大豆苷元和钩藤碱替代了浓缩型脉君安片中的葛根总黄酮和钩藤总碱.大豆苷元、和厚朴酚的口服生物利用度低，临床疗效不理想[10-14]. 研究表明大豆苷元、和厚朴酚分别制备成长循环脂质体可以促进药物的口服吸收，同时使其平缓释放，延长药物在体内的驻留时间，减少服药次数[15-17]. 因此我们设计并研制了大豆苷元与和厚朴酚复方长循环脂质体，再按处方剂量与氢氯噻嗪、钩藤碱及相应辅料压制成片剂，制备加味脉君安脂质体片剂，以期提高各成分的生物利用度，增强体内抗氧化应激及抗炎能力，改善原方剂长期使用产生的降压抵抗.研究表明，脉君安片主要降压活性成分的释放与吸收同步性较差，导致无法实现整体协同作用[18-20].因此，本研究以体外释放相似因子(f2)为指标，考察了新方剂主要指标成分和厚朴酚、大豆苷元、氢氯噻嗪与钩藤碱的体外同步均匀释放情况.

1 材料

1.1 主要试剂和厚朴酚(批号20131118，质量分数≥98%，武汉泰凯塞科技有限公司)；大豆苷元(批号C06N6Y5504，质量分数 ≥98%，上海源叶生物有限公司)；钩藤碱(批号20170910，质量分数 ≥ 98%，上海鼎瑞化工有限公司)；氢氯噻嗪(批号20160913，质量分数 ≥ 98%，武汉泰凯瑟科技有限公司)；大豆磷脂酰胆碱(上海艾韦特医药科技有限公司)；脉君安片(批号170171，国药集团中联药业有限公司)；预胶化淀粉PC-10(批号7094，日本旭化成)；交联聚维酮(批号03100269039，美国亚什兰)；微晶纤维素(批号20141211，国药集团化学试剂有限公司)；分析纯氯仿(国药集团化学试剂有限公司)；聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(mPEG2000-DSPE)(批号B50845，上海东尚医药科技有限公司)；胆固醇(批号B41239，上海艾韦特医药科技有限公司)；色谱纯甲醇(美国Tedia公司)；色谱纯乙腈(美国Tedia公司)；屈臣氏蒸馏水；透析袋8000-14000(BioSharp公司).

1.2 主要仪器日本岛津高效液相色谱仪(包括LC-20AD二元泵、SPD-20A紫外检测器、CTO-20AC柱温箱、SIL-20ACHT 自动进样器、LC-Solution 工作站)；美国Gilson P型移液器；Mettler Toledo公司MS105DU型半微量分析天平；Sigma公司2K15C型高速离心机；上海亚荣生化仪器RE-2000A型旋转蒸发器；宁波新芝JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机；北京博医康实验仪器有限公司FD-1 A-50型冷冻干燥机；英国MALVEN 公司ZS90激光粒度分析仪；日本电子公司JEM-2100 (HR) 透射电子显微镜；北京国药龙立科技有限公司DP30 A单冲式压片机；天津天大天发ZRS-6G智能溶出试验仪.

2 方法与结果

2.1 大豆苷元与和厚朴酚复方长循环脂质体的制备采用薄膜-超声分散法制备大豆苷元与和厚朴酚复方长循环纳米脂质体.按表1所示比列称取成膜材料(大豆磷脂酰胆碱、胆固醇、mPEG2000-DSPE)，以及大豆苷元与和厚朴酚各6.23 mg(药脂比为1∶10)，涡旋震荡溶于50 mL氯仿-甲醇混合液(1∶4，V/V)中，在40 ℃及减压条件下旋转蒸发60 min(转速为100 r/min)，使有机溶剂蒸发，直至茄形瓶内壁形成一层薄膜.加入100 mL超纯水(使磷脂浓度为0.1%)，于60 ℃下磁力搅拌，水化60 min.水化后的脂质体于冰浴下超声处理(80 W、180次)，均化后脂质体混合液通过0.22 μm滤膜进行整粒3次，制得大豆苷元与和厚朴酚复方长循环脂质体混悬液.

表1 复方脂质体的物质组成与质量比

2.2 加味脉君安脂质体片剂的制备按大豆苷元∶和厚朴酚∶氢氯噻嗪∶钩藤碱=40∶40∶11∶75比例(w/w)，量取大豆苷元与和厚朴酚复方长循环脂质体混悬液，按表2所示处方比例加入氢氯噻嗪、钩藤碱、处方量半量的稀释剂预胶化淀粉和崩解剂交联聚维酮，于-80 ℃下预冻3 h后冷冻干燥.冻干后的粉末再与剩余的稀释剂、崩解剂和润滑剂硬脂酸镁充分混合，过16目筛后用10 mm冲模直接压片，制得加味脉君安长循环脂质体片剂(片重0.5 g).

表2 加味脉君安长循环脂质体片剂的物质组成与比例

按“2.3”节方法检测片剂中大豆苷元、和厚朴酚、氢氯噻嗪和钩藤碱含量.

2.3 含量测定方法的建立

2.3.1 色谱检测条件 色谱柱为Phenomenex ODS C18分析柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)接保护柱(30 mm×10 mm，3 μm)，柱温40 ℃；流动相为10 mmol/L乙酸铵水溶液(A)和甲醇(B)，梯度洗脱(0～4 min，20%～45%B；4～9 min，45%～85%B；9～11 min，85%～77%B；11～12 min，77%～20%B；12～14 min，20%B；检测波长0～4 min为270 nm，4～9 min为235 nm，9～11 min为245 nm，11～14 min为294 nm)，流速为1 mL·min-1；进样量10 μL.

现如今，在环境工程建设发展过程当中仍然存在着诸多的问题，是与整个城市规划有着巨大的差距的，有一部分城市环境保护工程建设还是和国家所提出的要求有着一定的差距的，在污水处理和垃圾清理、城市绿化上还是有一定的发展空间的。在城市环境工程建设过程中，城市污水处理的问题较为严重，运用的技术手段比较落后，设施建设比较落后，直接将工业污水和生活污水排放到河流当中，不经过科学的处理技术。

2.3.2 对照品和供试品溶液的制备 分别精密称取氢氯噻嗪、大豆苷元、钩藤碱、和厚朴酚标准品10.00 mg，甲醇溶解并定容至10 mL，作为对照品储备液(1 mg/mL).取各物质的对照品储备液用甲醇稀释，得到浓度为51.2、25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 μg/mL的对照品溶液.

取制备好的加味脉君安长循环脂质体片剂l片，置于50 mL烧杯中，加入适量蒸馏水，超声处理30 min，使其完全崩解，且溶液不产生气泡，移至50 mL容量瓶，定容，得供试品溶液.

2.3.3 线性关系考察 精密吸取氢氯噻嗪、大豆苷元、钩藤碱、和厚朴酚1 mg/mL的对照品储备液适量，用甲醇逐步稀释成51.2、12.8、3.2、0.8、0.2、0.05 μg/mL系列溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样检测，以各物质的峰面积为纵坐标(Y)，以目标药物浓度为横坐标(X)进行线性回归，各目标药物的线性回归方程见表3，线性范围为0.05～51.2 μg/mL.

表3 氢氯噻嗪、大豆苷元、钩藤碱、和厚朴酚的线性回归方程

2.3.4 方法专属性 分别以空白脂质体加压片辅料混悬离心上清液，待测物对照品溶液离心上清液(10.24 μg/mL)和供试品混悬液离心上清液(10.24 μg/mL)按“2.3.1”项下色谱条件进样检测，结果见图1A、1B和1C. 结果表明处方中的辅料不干扰4种目标药物的测定，该方法专属性良好.

1：氢氯噻嗪；2：大豆苷元；3：钩藤碱；4：和厚朴酚A: 空白脂质体加压片辅料；B: 对照品溶液；C: 供试品溶液图1 专属性色谱图

2.3.5 精密度与重复性试验 用甲醇配制低、中、高(0.2、6.4、51.2 μg/mL)3个浓度的质控工作液，每份平行测定6次.氢氯噻嗪、大豆苷元、钩藤碱、和厚朴酚的RSD分别为0.99%、1.17%、1.22%、1.56%，表明该方法的精密度良好.

取供试品储备液，用甲醇稀释成低中高(0.2、6.4、51.2 μg/mL)3个浓度的供试品溶液，每份平行测定6次，氢氯噻嗪、大豆苷元、钩藤碱、和厚朴酚的RSD分别为0.71%、0.96%、0.74%、0.72%，表明该方法重复性良好.

2.3.6 加样回收率试验 精密量取对照品供试液，加入空白脂质体(含压片辅料)，甲醇稀释成浓度为低中高(0.2、6.4、51.2 μg/mL)3个浓度的供试品溶液各6份，离心取上清液测定. 氢氯噻嗪、大豆苷元、钩藤碱、和厚朴酚的平均回收率分别为95.1%(RSD=2.2%)、98.4%(RSD=1.5%)、102.2%(RSD=1.7%)、95.3%(RSD=1.78%)，表明该方法满足分析需求.

2.3.7 稳定性试验 精密量取供试品储备液，用甲醇稀释成低中高(0.2、6.4、51.2 μg/mL)3个浓度，离心取上清液作为供试品工作液(n=6)，分别在0、2、4、6、12和24 h进样分析，氢氯噻嗪、大豆苷元、钩藤碱、和厚朴酚的平均RSD分别为1.32%、2.01%、1.71%、2.21%，表明供试品溶液稳定.

脂质体混悬液经ZS90激光粒度分析仪测定，大豆苷元与和厚朴酚复方长循环脂质体的平均粒径为(172.433±1.401) nm，PDI为0.235±0.004，zeta电位为(-44.3±1.25) mV.脂质体粒度分布见图2，表明在该制备工艺条件下，所制备的复方脂质体粒度分布窄，大小分布均匀.

图2 大豆苷元与和厚朴酚复方长循环脂质体的粒径分布图

将大豆苷元与和厚朴酚复方长循环脂质体混悬液用纯水稀释10倍，用镊子夹住铜网边缘捞取脂质体，室温自然干燥后用磷钨酸复染，待完全干燥后采用TEM(加速电压200 kV；电子枪为 LaB6；分辨率为0.14 nm)，观察微粒的形状和结构，见图3.由图所示，制备的大豆苷元与和厚朴酚复方长循环脂质体为圆形或椭圆形，脂质体大小基本均匀一致.

图3 大豆苷元与和厚朴酚复方长循环脂质体的TEM图

2.5 片剂的体外累积释放率与同步释放相似性分析按照《中华人民共和国药典》(2020版)四部“0931溶出度与释放度测定法”规定[21]，采用浆法测定加味脉君安脂质体片剂和市售脉君安片的体外释放度.取上述片剂置于500 mL水中，桨转速为100 r/min，水浴温度为(37±0.5) ℃，分别于5、15、30、45、60、90、120、240、360、480、600、720、1 440 min取样6 mL，并及时补充等温度等体积的空白溶出介质.每个时间点的样品经12 000 r/min离心10 min后取上清液，按“2.3”项下方法检测目标物含量.

100%溶出量测定：取加味脉君安脂质体片剂、市售脉君安片分别置于容量瓶中，加溶出介质适量，超声使完全崩解，加溶出介质定容至500 mL，摇匀后取1 mL混悬液1 200 r/min离心10 min，取上清液测定目标物含量，作为目标物100%溶出量.

累积释放率计算公式：

累计释放率Q(%)=[V1×(C1+C2+…+Ci-1)+V2×Ci]/(V0×C0)×100%，

其中V1为每个时间点的取样量，V2为溶出介质体积，C1～Ci为每个时间点测得的物质的浓度，V0为100%溶出时介质的体积，C0为100%溶出时物质的浓度.

采用相似因子法评价加味脉君安脂质体片剂主要成分体外释放的同步性.相似因子(f2)用如下公式计算：

f2=50×lg {[1+1/n∑(Rt-Tt)2]-1/2× 100}，

其中，Rt为参比样品t时的释放度，Tt为试验样品t时的释放度，n为试验取样点.如果50≤f2≤100，表明两制剂的释放曲线在各个观测点的平均差值不超过10%，释放度曲线相似.f2值越接近100，两条释放曲线的相似度越高[22].

加味脉君安脂质体片剂和市售脉君安片的体外累积释放曲线见图4所示.由图可知，加味脉君安长循环脂质体片剂在8 h大豆苷元、和厚朴酚、氢氯噻嗪和钩藤碱的累积释放率分别为90.3%，93.4%，100%和84.9%，24 h各组分的累积释放率均为100%.市售脉君安片在1 h氢氯噻嗪、大豆苷元和钩藤碱的累积释放率分别为97.7%，87.2 %和99.7%，2 h各组分的累积释放率均为100%.上述结果表明，与市售脉君安片相比，新制剂主要降压活性成分的体外释放缓慢，预期体内具有一定的缓释效果，更符合高血压的用药特征.

图4 加味脉君安脂质体片剂(A)及市售脉君安片(B)各组分累积释放率曲线

加味脉君安脂质体片剂各组分间的同步释放相似因子见表4.表中结果显示各组分之间同步释放因子f2均大于50，表明该制剂中各组分在释放介质中的体外同步释放情况较好，预期体内将具有较好的协同降压作用.

表4 加味脉君安脂质体片剂各组分的同步释放相似性

3 讨论

大豆苷元属于异黄酮化合物[23]，是脉君安片组方中葛根的主要效应成分，因其较差的溶解特性和较低的渗透性[24]，口服吸收少，生物利用度低[11]，而和厚朴酚也存在体内半衰期较短的缺点[25]，因此本研究先采用薄膜-超声分散法将大豆苷元与和厚朴酚制备成复方长循环纳米脂质体，再与脉君安组方中的氢氯噻嗪和钩藤碱混合后加入相应的辅料制备成加味脉君安脂质体片剂，预期可以改善效应成分的胃肠道吸收、提高体内生物利用度、减少服药频次，且由于和厚朴酚的加入，克服了市售脉君安长期使用易产生降压抵抗的缺点，后续将设计一系列的体内外试验进行验证.

中药制剂多组分的同步释放与吸收是获得系统整体协调作用、提高临床疗效的必要条件.加味脉君安脂质体片剂中包括大豆苷元、钩藤碱、和厚朴酚和氢氯噻嗪等多个组成，释放的非同步势必造成相互间的转运时差和起效时差，致使组分间的协调作用无法发挥. 因此，在进行多个组分的长循环脂质体制剂研究中，除了考察粒径、包封率等重要理化指标，还建立了相似因子法考察多组分的释放，力求通过多组分同步释放而平稳地发挥原方的真实疗效，以期达到中药的整体、同步、综合作用. 体外释放度考察表明，加味脉君安脂质体片剂各组分之间同步释放因子f2均大于50，在释放介质中的体外同步释放情况较好，且具有一定的缓释效果，为今后的动物体内药代动力学实验提供一定的数据和理论支持.