钛金属表面构建介孔氧化硅薄膜载药系统用于BMP-2缓释

黄芳 毕玮 孙杨 刘玉普 李伟

1复旦大学附属中山医院厦门医院口腔科，福建 361015；2复旦大学附属中山医院口腔科，上海 200032；3复旦大学化学系，上海 200438

目前临床上广泛使用的口腔种植体基底材料多数为钛及其合金材料［1］，然而，由于钛基金属表面易形成致密氧化薄膜［2-3］，导致植体的骨结合能力大大降低［4-5］，因此对植体表面进行改性和修饰，以提高植体早期骨结合能力成为国内外学者研究的热点［6-8］。其中，将具有较强诱导成骨能力的生长因子负载于植体表面，以提高钛表面的骨结合能力，是对钛基种植体进行表面改性的一个重要途径［9］。

在骨生长因子方面，目前已有研究证明骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）是BMPs 中具有最强成骨诱导能力的生长因子［10-14］。其在机体内可诱导大量未分化的间充质干细胞转化成成骨细胞，促进早期成骨［15］；同时又能刺激成骨细胞的增殖、分化，提高碱性磷酸酶的活性以促进骨的形成［16］。然而，由于BMP-2 在体内半衰期较短和易被蛋白酶分解等因素，造成植体周围药物浓度不足，而不能发挥其诱导成骨的作用，所以会造成药物的浪费［17-18］。因此，构建一种既能生长于钛金属表面，又能以适宜的浓度和速率稳定释放BMP-2 的载药系统对提高植体的早期成功率具有积极的作用。

介孔氧化硅是一种孔径大小可以在2～50 nm 范围内精确调控的新型纳米材料［19-24］。其灵巧、多变的合成方式使之可完美地生长于众多基底（金属、非金属）表面；高的比表面积、大的孔径可使之具有更高的载药量；可调的表面性质可实现药物分子的选择性吸附；刚性结构的介孔骨架可为客体分子提供保护支撑；低生物毒性以及生物可降解性可使之具有更好的生物相容性；表面存在的大量羟基基团使之具有多变的后修饰潜力，进而可实现药物的可控负载以及释放［25-27］。这些特性使基于介孔氧化硅的纳米药物输送体系成为众多科研工作者的研究热点。

然而，迄今为止，将介孔氧化硅材料应用于种植体表面处理的相关报道很少。若能将此新型材料生长于钛金属种植体表面，并负载BMP-2，在植体的局部形成一个缓释药物分子的微环境，将为促进种植体早期发生骨结合、缩短临床一期愈合时间提供有利条件。因此，本研究旨在构建可缓释BMP-2 的钛金属表面介孔氧化硅薄膜（mesoporous silica membranes on titanium substrates，Ti@mSiO2）载药系统，为促进种植体早期骨结合提供适宜的生物材料。

1 材料与方法

1.1 载药系统的制备 采用油水两相反应法合成薄膜，其中将钛箔作为生长基底。典型的反应过程如下：8 ml 25 wt % 十六烷基三甲基氯化铵溶液（CTAC）（Sigma-Aldrich，美国）和0.075 ml 三乙醇胺（TEA）（Sigma-Aldrich，美国）先后加入到12 ml 去离子水中，并置于50 ml的圆底烧瓶中，加入一片钛箔片（1.5 cm×1.5 cm），在60 ℃油浴中温和地搅拌1 h后，加入7 ml浓度为10%的正硅酸四乙酯（TEOS）-环己烷（中国国药集团化学试剂有限公司）溶液，从而形成了油水两相体系，并继续反应120 min。反应结束后，取出钛箔片，用水和乙醇分别洗3 次，得到as-made介孔薄膜。通过在马弗炉中600 ℃条件下焙烧3 h 得到介孔氧化硅薄膜，命名为Ti@mSiO2。

1.2 材料表征的观察与元素分析 使用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）对载药系统Ti@mSiO2表面介孔孔道进行观察；使用X 射线能谱仪（EDS）分析载药系统Ti@mSiO2及Ti@mSiO2@BMP-2 表面元素成分，其能谱数据由配置牛津能谱仪的S-4800 FE-SEM 测得，工作电压为1 kV，工作电流10 μA。

1.3 Ti@mSiO2对BMP-2 的负载量 BMP-2 用纯水配制成1.0 μg/ml 的溶液。以吸附动力学实验为例，研究不同吸附时间对BMP-2 吸附量的影响，其步骤如下：将同样大小（1.5 cm×1.5 cm）的钛片及Ti@mSiO2片各10 片，分别浸入到装有2.5 ml BMP-2 溶液（1.0 μg/L）的称量瓶（30×50 mm）中，并在25 ℃环境中摇动。在每一个设好的时间点分别取出一片钛片，瓶中剩余的BMP-2 浓度由紫外-可见光分光仪测量，并对比线性方程计算得出吸附量，即负载量。其他对比试验均在相同条件下进行。

吸附平衡：介孔薄膜对BMP-2 分子的吸附率（即负载率）（P）可以由公式：P＝［（C0－Ct）/C0］×100%计算得到。其中，C0与Ct分别表示溶液的初始浓度与吸附时间为t时的浓度（单位μg/cm3）。

介孔薄膜对BMP-2 的吸附量（即负载量）由公式：Qe＝（C0－Ce）×V/S计算推得。Ce代表溶液吸附平衡时的浓度（μg/cm3），S代表介孔薄膜的面积（～4.5 cm2），V代表溶液的体积（2.5 ml），Qe代表该条件下平衡时的吸附量（μg/cm3）。

1.4 Ti@mSiO2载药系统的药物释放 将同样大小（1.5 cm×1.5 cm）的钛片及Ti@mSiO2片各12 片，分别称取15 μg BMP-2 用纯水配制成溶液后滴至钛及Ti@mSiO2片上，在常温下（25 ℃）真空干燥。再将钛片分别浸入到装有2.5 ml PBS 的带盖烧杯中，置于37 ℃恒温水浴箱中避光振荡。在每一个设好的时间点分别取出一片钛片，瓶中剩余的BMP-2 浓度由紫外-可见光分光仪测量（280 nm），并对比线性方程计算得出释放量。其他对比试验均在相同条件下进行。

2 结 果

2.1 载药系统Ti@mSiO2的表征 FE-SEM 照片清晰地显示出反应前后钛金属表面的变化（图1）。放大的SEM照片显示钛金属表面非常粗糙（图1B），有很多的棒状条，棒状条之间有非常明显的孔洞，这非常有利于植体与动物或人体有机体的亲和。经过反应后，介孔氧化硅薄膜生长于这些棒状条的表面（图1D），并且仅有极薄的厚度，保留与钛箔表面完全相同的形状，说明本工作所研发的介孔薄膜可灵活生长于钛金属材料表面，不会改变材料本身的基本框架，未来也可以通过改变钛金属的尺寸与形状，得到相同形貌的薄膜材料，进而实现器件化的定制。

图1 不同放大倍数下的钛箔扫描电子显微镜（SEM）照片（A、B）和生长介孔氧化硅薄膜的钛箔SEM照片（C、D）

此外，介孔薄膜在大的范围内是连续、光滑、无裂痕的。高倍电镜照片显示膜表面由～10 nm大小的介孔排列而成，没有发现条形介孔孔道，表明了垂直导向介孔的存在［28-31］。以上结果充分证明具有垂直孔道氧化硅薄膜成功生长于钛金属表面。

图2 显示了Ti@mSiO2的一个片层区域SEM 照片以及区域对应的Ti、硅（Si）、氧（O）三种元素的面扫描谱图，结果表明Ti@mSiO2表面有非常明显的Si 和O 元素含量，且Si和O 元素均匀分散于Ti金属表面，进一步说明介孔氧化硅薄膜成功地均匀生长于钛金属微观表面。

图2 钛金属表面介孔氧化硅薄膜（Ti@mSiO2）的扫描电子显微镜（SEM）照片（A）以及相应区域的钛（Ti）、硅（Si）、氧（O）三种元素的面扫面图（B、C、D）

2.2 载药系统Ti@mSiO2对BMP-2 的负载 在载药系统Ti@mSiO2的载药实验中，BMP-2作为一种大分子量的蛋白质被选为客体分子。SEM 照片以及对应区域的元素的面扫描图（图3）显示，经过自然吸附后，相较于Ti@mSiO2，其表面元素增加了大量的碳（C）和氮（N）元素，说明Ti@mSiO2成功吸附了大量的BMP-2蛋白。

图3 Ti@mSiO2@BMP-2 的SEM 照片（A）以及相应区域的Ti、O、Si、C、N 五种元素的面扫面图（B～F）

在吸附动力学方面，由已知配置的BMP-2 初始浓度（0.1～10.0 mg/L）与相应的紫外-可见光吸收光谱作图，其特征吸收峰分别位于为280 nm，且峰值大小与溶液浓度呈线性关系，将数据点进行线性回归分析得到线性拟合的回归方程：f（x）=0.016+0.014x（图4A），BMP-2 的吸附量根据此方程计算得出。测试结果显示，在20 min 的时间内，钛箔对BMP-2 的吸附就已经达到最大值，大约是0.019 μg/cm2（图4B），说明这是一个比较快速的吸附过程。之后随着吸附时间的增加，其吸附量并没有明显的增加，说明在20 min 时已经达到了吸附的平衡状态。相比之下，Ti@mSiO2的吸附效率有了更大的提高，尽管介孔氧化硅薄膜在钛箔的表面只有薄薄的一层，但是其吸附量高达0.206 μg/cm2，大约是纯钛金属的10.5 倍。其良好的吸附性能主要归因于以下3 点：（1）介孔氧化硅薄膜具有超薄的厚度，因此为BMP-2 分子的扩散以及与介孔表面的相互作用提供了超短的扩散路径；（2）介孔氧化硅薄膜的孔道是垂直开放式的，由于BMP-2 分子更接近于线性或平面的构型，垂直开放的直型孔道更能促进它的密堆积；（3）介孔氧化硅薄膜有一个大的孔径（～10 nm），该孔径远大于BMP-2 分子的大小，这对于BMP-2 分子的扩散和传输来说没有明显的空间阻碍，因此有利于BMP-2 分子吸附到内部的介孔表面［28-31］。

图4 BMP-2 的紫外-可见光吸收光谱与浓度（0.1～10.0 mg/L）之间的标准曲线（A）；钛（Ti）箔以及Ti@mSiO2对BMP-2吸附效率随时间变化的曲线（BMP-2溶液初始浓度为1.0 mg/L）（B）

2.3 Ti@mSiO2载药系统对BMP-2 的缓释效果 在BMP-2 分子的释放性能测试中，钛以及Ti@mSiO2分别负载等量的BMP-2（15 μg）。为模拟种植体环境，采用静态释放方法（图5A）。图5B 显示，在静态溶液中，钛箔负载的BMP-2可以在3 h内完全释放，表现出一个非常快的释放过程。形成鲜明对比的是，Ti@mSiO2的释放速度很慢，需要72 h才能完全释放，缓释效果提高了23倍，说明介孔结构的存在有效提升了体系的缓释效果，这主要归功于以下2 点：（1）具有开放介孔孔道的氧化硅薄膜为BMP-2 分子提供了更大的纳米级存储空间，从而减小了BMP-2 分子与水分子在静态条件下的接触面积，提高了BMP-2的控释性能；（2）介孔孔道的毛细管作用力、介孔氧化硅与BMP-2 分子之间的氢键作用力都有效减缓了BMP-2 分子从介孔中释放的速度。以上结果说明，介孔薄膜的存在有助于提高载药系统的缓释效果［31］。

图5 BMP-2 从载药系统缓释的实验过程（A）；Ti@mSiO2载药系统对比纯钛（Ti）缓释时间曲线（B）；BMP-2 分子从载药系统Ti@mSiO2（左）与钛片（右）中释放效果示意图（C）

3 讨 论

本实验采用油水两相法，成功在钛金属表面制备出具有垂直开放孔道的介孔氧化硅薄膜。Ti@mSiO2具有完整的厘米尺度上的形态、超薄的厚度、随金属表面微观结构而改变的特性，因此赋予它作为药物载体的良好条件。Ti@mSiO2相较于纯钛，其对BMP-2 具有高达0.206 μg/cm2的负载量。这主要归功于介孔氧化硅薄膜所特有的优点：一是Ti@mSiO2超大的比表面积提供了大量羟基官能团，这些羟基官能团通过氢键显著提高它们与更多BMP-2分子的亲和力；二是垂直的介孔结构有利于BMP-2 分子在较少空间障碍的情况下，自由地向介孔内部迁移和扩散；三是垂直介孔的低界面曲率与BMP-2 分子的平面形状非常吻合，这样就方便了它们的紧密聚积。本实验利用介孔氧化硅薄膜直接吸附BMP-2，负载过程简单，不会破坏生长因子的活性。同时，Ti@mSiO2载药系统的药物缓释效果明显，释放时间延长到72 h，是纯钛片的24倍，这同样归功于介孔氧化硅薄膜介孔孔道对BMP-2 分子的阻隔作用和氢键作用力。

综上所述，Ti@mSiO2可有效负载、缓释BMP-2分子，是较为理想的载药系统，本课题组未来将从细胞层面上研究此载药系统对骨结合的促进作用。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突。