过表达miR-4731-5p通过调节PRR11表达对结直肠癌HT-29细胞增殖和凋亡的影响

汤守元 兰国玉 黄耿 朱钟钟 罗海平 姜进平

1鄂东医疗集团黄石市中心医院（湖北理工学院附属医院）胃肠肛肠外科 435000；2鄂东医疗集团黄石市中心医院（湖北理工学院附属医院）泌尿外科 435000

结直肠癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，也是肿瘤相关死亡的主要原因，结直肠癌发病年龄呈现年轻化的趋势，且其发病率在不断上升［1］。恶性增殖和凋亡减少是结直肠癌细胞的重要生物学特征，结直肠癌细胞增殖和凋亡水平的改变与众多分子信号通路的激活或失活有关［2］。因此，结直肠癌发病机制的研究有助于结直肠癌新型治疗靶点的发现。微小RNA（miRNA，miR）的表达与结直肠癌细胞的增殖活力和凋亡水平有关，体外研究和体内研究均表明miRNA 参与调控结直肠癌的发生发展，与结直肠癌的临床分期、恶性程度、化疗耐药等相关［3-4］。研究显示，黑色素瘤患者血清中存在miR-4731，相对于Ⅲ期黑色素瘤患者，miR-4731 在Ⅳ期患者的转移性黑色素瘤组织中表达较少，miR-4731 过表达能够抑制黑色素瘤细胞的集落形成，miR-4731 表现为抑癌基因作用［5］。miR-4731-5p 对结直肠癌发生发展的影响及其作用机制尚不明确。本研究旨在观察miR-4731-5p对结直肠癌细胞增殖活力和凋亡水平的作用，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂 结直肠癌HT-29 细胞购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；阴性序列miR-NC、miR-4731-5p 类似物购于上海碧云天生物技术有限公司；DMEM 培养基购于美国Gibco 公司；胎牛血清购于杭州四季青生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒购于上海生工生物工程股份有限公司；Lipofectamine 3000 转染试剂和实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）试剂盒购于购自美国Invitrogen 公司；超敏ECL发光试剂盒购于美国Thermo 公司；蛋白浓度测定试剂盒购于上海碧云天生物科技有限公司；一抗CDK3、GAPDH、c-IAP1、富含脯氨酸蛋白11（proline-rich protein 11，PRR11）和辣根过氧化物酶标记的二抗购于美国BD公司。

1.2 细胞培养和转染 取出液氮罐冻存的结直肠癌HT-29细胞，快速复苏后接种于含10%胎牛血清DMEM培养基中，于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。取对数生长期的HT-29 细胞接种于24 孔板，按照Lipofectamine 3000 试剂说明书，分别转染miR-4731-5p 类似物（miR-4731-5p组）和阴性对照miR-NC（miR-NC 组）。转染8 h 后更换完全培养基，培养24 h分析转染效率。

1.3 生物信息学预测miR-4731-5p 的靶基因 采用生物信息学软件miRTarBase 分析miR-4731-5p 的靶基因，PRR11 基因信使RNA（mRNA）存在miR-4731-5p 的结合位点，提示PRR11可能是miR-4731-5p的靶基因。

1.4 qRT-PCR 检 测miR-4731-5p 和PRR11 mRNA 的相对表达量 提取转染24 h 的HT-29 细胞总RNA，分别检测RNA 纯度和浓度，反转录合成cDNA。配制qRT-PCR 反应液，miR-4731-5p 的相对表达量以U6 为内参，PRR11 mRNA 的相对表达量以GAPDH 为内参。引物序列如下：miR-4731-5p正向引物5’-CACACTCATGTGGCCCCCAGC-3’，反向引物5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ ；U6 正向引物5’-TGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTC-3’，反向引物5’-CCAGTCTCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；GAPDH 正向引物 5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反向引物5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’；PRR11 正向引物5’-GAAGCTGGCTAACATCATCCTG-3’，反向引物5’-CTCTGGGTTATGCAGTTCTGG-3’。根据2-ΔΔCt方法计算miR-4731-5p和PRR11 mRNA的相对表达量。

1.5 Western blot 检测HT-29 细胞中PRR11 蛋白表达量 收集转染48 h 的HT-29 细胞，配制蛋白裂解液并提取总蛋白，测定蛋白浓度。配制十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，每组取20 μg 蛋白样品电泳，将蛋白转至硝酸纤维素膜，7%脱脂牛奶在摇床上封闭4 h。依照稀释比为1∶1 000配制一抗，4 ℃孵育过夜。依照稀释比为1∶5 000配制二抗，室温摇床孵育4 h。配制发光液，在每条条带上滴加发光液，在荧光成像仪中曝光和拍照。

1.6 集落形成实验检测miR-4731-5p 对HT-29 细胞增殖的影响 收集转染48 h 的HT-29 细胞，以2×103个/孔接种于6 孔板，每组3 个复孔，于培养箱连续培养14 d。将集落与3%的多聚甲醛进行混合，采用质量分数0.3%的结晶紫溶液染色40 min。流水清洗，在室温下晾干，计数集落形成数，计算平均值。

1.7 流式细胞术检测miR-4731-5p对HT-29细胞凋亡的影响 收集转染48 h 的HT-29 细胞，采用PBS 溶液洗涤4 次，离心弃上清，采用600 μl 结合液重悬细胞，加入5 μl Annexin V-FITC 溶液充分混匀，加入5 μl 碘化丙啶溶液充分混匀。避光孵育20 min 后，采用流式细胞仪分析每组HT-29细胞的凋亡率。

1.9 统计学分析 采用SPSS 21.0软件进行统计分析，计量资料符合正态分布，均以均数±标准差（±s）表示，两组间比较应用独立样本t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组HT-29 细胞中miR-4731-5p 的相对表达量miR-NC 组和miR-4731-5p 组HT-29 细胞中miR-4731-5p的相对表达量分别为（1.05±0.16）和（7.91±1.26），miR-4731-5p 组miR-4731-5p 的表达是miR-NC 组的7.53倍，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 生物信息学预测miR-4731-5p 的靶基因 采用生物信息学软件miRTarBase 对miR-4731-5p 的靶基因预测，miR-4731-5p 的靶基因可能是PRR11，miR-4731-5p 可能与PRR11基因mRNA的结合位点见图1。

图1 miR-4731-5p与PRR11基因mRNA互补结合位点

2.3 过表达miR-4731-5p对PRR11 mRNA相对表达量的影响 miR-NC 组和miR-4731-5p 组HT-29 细胞中PRR11 mRNA的相对表达量分别为（1.02±0.12）和（0.28±0.11），差异有统计学意义（P＜0.01），提示miR-4731-5p 可有效抑制PRR11 mRNA的表达。

2.4 过表达miR-4731-5p 对PRR11 蛋白表达量的影响 Western blot 结果（图2）表明，miR-4731-5p 组HT-29 细胞中PRR11 蛋白表达降低，细胞增殖蛋白CDK3表达降低，细胞凋亡抑制蛋白c-IAP1表达降低。

图2 miR-4731-5p对HT-29细胞PRR11蛋白表达的影响

2.5 过表达miR-4731-5p 对HT-29 细胞增殖水平的影响 如图3，miR-NC 组和miR-4731-5p 组HT-29 细胞的集落形成数分别为（148.90±20.55）个和（51.25±12.81）个，差异有统计学意义（P＜0.01），提示miR-4731-5p 可抑制结直肠癌HT-29细胞的增殖。

图3 miR-4731-5p对HT-29细胞增殖能力的影响

2.6 过表达miR-4731-5p 对HT-29 细胞凋亡能力的影响 如图4，miR-NC 组和miR-4731-5p 组HT-29 细胞凋亡率分别为（5.79±0.72）%和（22.19±2.62）%。与miR-NC 组相比，miR-4731-5p 组HT-29 细胞凋亡率明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01），提示miR-4731-5p 可促进结直肠癌HT-29细胞凋亡。

图4 miR-4731-5p对HT-29细胞凋亡水平的影响

3 讨 论

最近的系列研究表明，miRNA 在结直肠癌中表达上调或下调，显著影响结直肠癌细胞的代谢、分化、生长及凋亡等过程，表现为明显的抑癌基因或致癌基因作用［6-7］。Zhang等［8］研究发现，miR-802在结直肠癌组织和细胞系中显著下调，miR-802表达水平低的结直肠癌患者淋巴转移和远处转移率显著升高，且总生存率更差，转染miR-802模拟物显著减弱结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。Liu 等［9］研究发现，有转移的结直肠癌患者血清外泌体miR-106b-3p的表达水平显著高于无转移患者，血清外泌体miR-106b-3p 高表达与不良预后相关，外泌体miR-106b-3p 在体内促进结直肠癌细胞的肺转移。其中，miR-4731-5p 在神经胶质瘤、黑色素瘤等肿瘤组织中低表达，能够抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭［5，10］。miR-4731-5p 对结直肠癌增殖和凋亡水平的调控尚不清楚。

本研究结果显示，过表达miR-4731-5p 后，HT-29 细胞增殖活力降低，细胞凋亡率增加，表明miR-4731-5p在结直肠癌细胞中表现为抑癌基因作用。已有研究证实，miRNA以不完全互补的方式配对结合靶基因mRNA，诱导沉默复合体的形成，降低靶基因的表达［11］。本研究采用生物信息学软件miRTarBase 预测显示，miR-4731-5p 可能与PRR11基因mRNA 配对结合。PRR11基因定位于人类染色体17q22，由360 个氨基酸组成［12］。PRR11 蛋白在胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌等多种肿瘤组织中高表达，与组织分化程度、TNM分期、淋巴结转移、肿瘤大小相关，沉默PRR11 可抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭，促进细胞凋亡的发生［13-15］。本研究结果显示，过表达miR-4731-5p 后，HT-29 细胞中PRR11 基因的相对表达量较miR-NC 组降低，表明miR-4731-5p 参与结直肠癌的机制可能是通过抑制PRR11 基因表达实现的。本研究Western blot 结果显示，miR-4731-5p 抑制PRR11 基因表达后，HT-29 细胞中增殖蛋白CDK3表达降低，凋亡抑制蛋白c-IAP1表达降低，提示HT-29细胞的增殖水平降低，细胞凋亡增加。

总之，过表达miR-4731-5p 可抑制结直肠癌HT-29 细胞的增殖活力，诱导HT-29细胞凋亡增加，其机制可能是通过抑制PRR11基因表达实现的。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突。