鹰嘴豆分离蛋白对猪肉肌原纤维蛋白乳化特性的影响

栗俊广，张旭玥，陈宇豪，王昱，刘骁，白艳红

1.郑州轻工业大学 食品与生物工程学院， 河南 郑州 450001；

2.河南省冷链食品质量与安全控制重点实验室， 河南 郑州 450001

0 引言

肌原纤维蛋白(Myofibrillar Protein，MP)是肌肉蛋白质中最主要的一种，约占肌肉总蛋白质含量的50%[1]. 肌原纤维蛋白的乳化特性直接决定肉制品的质构和持水保油能力，在肉类加工中对脂肪和水分的固定起着至关重要的作用. 在肉制品的储藏加工过程中，肌原纤维蛋白易受外界环境影响，如冷冻、加热等均可使其溶解度降低、乳化特性减弱，从而影响肉制品的品质[2]. 此时，添加外源植物蛋白(如大豆蛋白、乳清蛋白等)是改善肌原纤维蛋白乳液特性的常用手段，可以有效改善肌原纤维蛋白乳化特性，提高肉制品的品质[3-4].

鹰嘴豆(CicerarietinumLinn.)是世界第二大消费豆类，因其极高的蛋白质功效比值、生物利用价值和消化吸收率赢得了“豆中之王”的称号，近年来在中国云南、甘肃、新疆等地大面积种植[5]. 鹰嘴豆的蛋白质含量约占鹰嘴豆种子总质量的22%，并含有人体所需的18种氨基酸及8种必需氨基酸[6-7]. 鹰嘴豆分离蛋白(Chickpea Protein Isolate，CPI)是从鹰嘴豆中提取出的一种高纯度蛋白质，具有较高的溶解性、吸水性、保水性及乳化特性[8-11]，在肉制品生产加工中具有很好的应用前景. 目前，国内外学者对大豆分离蛋白与猪肉肌原纤维蛋白的相互作用已有大量研究.例如，梁婧等[12]建立了改性大豆分离蛋白与猪肉肌原纤维蛋白共混体系，发现经热改性处理后，该共混体系的乳化特性和凝胶特性均显著提高；朱佳倩等[13]研究发现，在猪肉肌原纤维蛋白中添加质量分数为10%的大豆分离蛋白可以显著提高混合凝胶的凝胶强度和保水性，而CPI对肌原纤维蛋白乳化特性的影响还鲜有报道. 基于此，本研究拟向猪肉肌原纤维蛋白中添加不同质量分数的CPI，研究其对猪肉肌原纤维蛋白乳液的乳化活性(Emulsion Activity Index，EAI)、乳化稳定性(Emulsion Stability Index，ESI)、流变特性等乳化特性的影响，以期为CPI在肉制品加工中的应用提供理论依据和参考.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鹰嘴豆，产自云南省文州自治区丘北市天星乡；猪里脊肉、金龙鱼大豆油，购于郑州丹尼斯百货有限公司；标准牛血清蛋白(Bovine Albumin，BSA)，北京索莱宝科技有限公司产. NaCl、MgCl2、NaH2PO4、Na2HPO4、HCl、NaOH，天津市大茂化学试剂厂产；十二烷基硫酸钠(SDS)，上海源叶生物有限公司产；正己烷，天津市富宇精细化工有限公司产；乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)，北京华迈科生物技术有限责任公司产.以上化学试剂均为分析纯.

1.2 主要仪器与设备

AB265-S型分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产；JA3003N型电子天平，上海箐海仪器设备有限公司产；101C-4型电热恒温鼓风烘箱，上海一恒科学仪器有限公司产；LM3100型锤式实验粉碎磨，瑞典波通公司产；T25型数显型高速匀浆机，德国IKA公司产；Lab-1-50型冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司产；SZ-22A型绞肉机，广州旭众食品机械有限公司产；GM200型刀式研磨仪，德国莱驰公司产；HH-42型水浴锅，常州国华电器有限公司产；Discovery型流变仪，美国TA仪器公司产；TU-1810型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产;TURBTSCAN LAB型稳定性分析仪，法国Formulaction仪器公司产.

1.3 实验方法

1.3.1CPI的提取参考栗俊广等[14]的方法，将脱脂鹰嘴豆粉与去离子水混合，调节混合溶液pH值至10.0，于40 ℃水浴条件下连续搅拌至充分溶解；于6000 r/min条件下离心15 min，将沉淀重复提取两次并收集上清液，调节上清液pH值至等电点后再次离心；收集蛋白沉淀物并加少量去离子水复溶，调节复溶溶液pH值为7.0，真空冷冻干燥后即到CPI.

1.3.2CPI化学成分的测定CPI水分、脂肪、蛋白质、灰分等化学成分均按照国标规定的检测方法进行测定[15-18].

1.3.3CPI理化性质的测定按照E.S.Tan等[19]的方法，分别测定CPI的持水力、持油力、乳化活性和乳化稳定性. 将0.1 g CPI与1.5 mL蒸馏水或大豆油(密度为0.912 g/mL)于10 mL离心管中涡旋混合1 min后称重，在室温下孵育30 min，于6526 r/min转速下离心30 min，弃上清液后称重. CPI的持水力和持油力分别按式①和式②计算：

①

②

式中，m1为样品、蒸馏水和离心管总质量/g；m2为弃上清液后混合样品和离心管总质量/g；m3为样品、大豆油和离心管总质量/g；m4为弃上清液后混合样品和离心管总质量/g.

用生理盐水缓冲液(0.6 mol/L NaCl，50 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH值为7.0)将CPI的质量浓度调整为0.1 mg/mL，加入与样品总体积相同的大豆油，使用高速匀浆机在10 000 r/min转速下匀浆2 min，再于3197 r/min转速下离心5 min，测量乳化液层高度. 对于乳液稳定性分析，按照上述方法制备样品后，于80 ℃条件下孵育30 min，于3197 r/min转速下离心5 min，测量乳化液层高度. CPI的乳化活性和乳化稳定性分别按式③和式④计算：

③

④

式中，VE为乳化层体积/mL；VT为总体积/mL；R为于80 ℃条件下孵育30 min后的乳化层体积/mL；Ri为初始乳化层体积/mL.

1.3.4 猪肉肌原纤维蛋白的提取按照J.G.Li等[20]的方法，将猪里脊肉解冻后，倒入4倍体积的冰肌原纤维蛋白提取液(0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L 磷酸盐缓冲液，10 mmol/L MgCl2和1 mmol/L EGTA，pH 值为7.0)，使用高速匀浆机在10 000 r/min的转速下匀浆60 s(每匀浆20 s间歇20 s)，于5460 r/min转速下离心15 min，弃上清液，并重复上述步骤两次；再加入4倍体积的冰NaCl溶液(0.1 mol/L)洗涤蛋白沉淀物，并于5460 r/min转速下离心15 min，弃上清液，重复该步骤3次，在最后一次离心前过滤，即得纯净的猪肉肌原纤维蛋白；将该蛋白置于冰水浴中，于4 ℃条件下储存，最长存放2 d. 猪肉肌原纤维蛋白质量浓度采用双缩脲法进行测定，以BSA作为标准蛋白绘制标准曲线.

1.3.5 猪肉肌原纤维蛋白乳液的制备用生理盐水缓冲液将猪肉肌原纤维蛋白的质量浓度调整为10 mg/mL. 分别加入质量分数为0、0.3%、0.6%、0.9%和1.2%的CPI，使用高速匀浆机在10 000 r/min的转速下匀浆60 s(每匀浆20 s间歇20 s)，于2229 r/min转速下离心5 min，以赶出蛋白中的气泡. 取20 mL混合蛋白溶液，加入总溶液体积20%的大豆油后混匀，即制得猪肉肌原纤维蛋白乳液. 将该乳液置于冰浴条件下，并于0～4 ℃冰箱中储存备用.

1.3.6 猪肉肌原纤维蛋白乳液EAI指数和ESI指数的测定参考K.N.Pearce等[21]的浊度法，并稍加修改. 吸取50 μL猪肉肌原纤维蛋白乳液，再加入5 mL质量分数为0.1% 的SDS溶液，漩涡振荡混匀后，于500 nm波长处测其吸光度，记为A0. 从乳液制备好即开始计时，10 min后再次从乳液底部相同位置吸取50 μL匀浆乳液，按照上述方法混合并测其吸光度，记为A10. 分别按照如下公式计算乳液的EAI指数和ESI指数：

⑤

⑥

式中，C为蛋白质质量浓度/(g·mL-1)；φ为油相体积分数，φ=20%.

1.3.7 猪肉肌原纤维蛋白乳液流变特性的测定按照K.Li等[22]的方法，并稍加修改. 取1.3.5中制备好的猪肉肌原纤维蛋白乳液，将乳液充分覆盖在40 mm平板底座测试平台上，切边后使用硅油密封. 夹缝间距0.5 mm，频率0.1 Hz，应变1%，初始温度25 ℃. 在25 ℃条件下保温5 min后，以1 ℃/min的升温速率加热至90 ℃. 测试指标为流变储能模量G′.

1.3.8 猪肉肌原纤维蛋白乳液总体稳定指数的测定使用稳定性分析仪测定乳液的总体稳定指数. 将被测样品装入样品池中，温度为室温(20 ℃)，设定扫描时间1 h和扫描间隔时间4 s. 测定样品的透射光(T)和被样品反射后的背散射光(Backscattering，BS)，通过软件分析总体稳定指数曲线获得乳液的总体稳定指数.

1.3.9 猪肉肌原纤维蛋白乳液乳析指数的测定参考刘竞男等[23]的方法，并稍加修改. 将1.3.5制备好的猪肉肌原纤维蛋白乳液立即装入带刻度的10 mL玻璃试管中，于4 ℃环境下分别静置1 h、2 h、4 h、8 h，记录乳析界面的高度变化. 按式⑦计算乳液的乳析指数：

⑦

式中，H0为清液的高度/cm；Ht为乳液的初始高度/cm.

1.4 数据处理

每个实验至少重复3次，每个样品的各项指标至少平行测定3次，实验结果以(平均值±标准差)表示. 采用SPSS 22.0中的Duncan′s test检验进行组间平均值显著性分析，利用Origin9.0作图.

2 结果与分析

2.1 CPI的化学成分和理化性质分析

CPI化学成分的测定结果显示，CPI中含 (6.03±0.85)%的水分、(1.90±0.22)%的脂肪、(3.80±0.28)%的灰分及 (81.90±4.22)%的蛋白质. 蛋白质持水力、持油力的大小是评价蛋白质品质的重要指标，持油力越高，蛋白质与脂质的结合能力越强. CPI理化性质的测定结果显示，每g CPI的持水力为 (3.21±0.08) g，持油力为 (5.85±0.35) g，高于已有报道的米糠蛋白((2.60±0.00) g,(5.00±0.30) g)和大豆蛋白((3.10±0.20) g,(2.60±0.10) g)；每g CPI的乳化活性为(28.17±1.34) m2，也高于该报道中测定的大豆分离蛋白((12.13±0.55) m2)[24]. 顾楠等[25]研究发现的CPI乳化稳定性(75%)低于本研究测得的结果(87.14±2.22)%.CPI的乳化稳定性差异可能与鹰嘴豆种类、提取方法、处理手段的差异有关. 本研究提取的CPI具有良好的持水力、持油力和乳化特性.

2.2 CPI添加量对猪肉肌原纤维蛋白乳液EAI的影响分析

EAI是指蛋白质在形成乳液过程中在油-水界面的吸附能力，它取决于蛋白质-油或蛋白质-蛋白质之间的相互作用[26]. CPI添加量对猪肉肌原纤维蛋白乳液EAI的影响如图1所示，其中不同小写字母代表差异显著(P<0.05,下同).由图1可以看出，随着CPI添加量的增加，猪肉肌原纤维蛋白乳液的EAI指数呈逐渐升高的趋势. 未添加CPI时，猪肉肌原纤维蛋白乳液的EAI指数为24.54 m2/g；随着CPI添加量的增加，猪肉肌原纤维蛋白乳液的EAI指数显著升高(P<0.05)，并在CPI添加量为1.2%时达到最大值，为30.49 m2/g. 这表明CPI的加入可提升猪肉肌原纤维蛋白的乳化能力，并在其添加量为1.2%时，猪肉肌原纤维蛋白能乳化的油量最多.

图1 CPI添加量对猪肉肌原纤维蛋白乳液EAI的影响Fig.1 Effect of CPI addition on EAI of pork myofibrillar protein emulsion

2.3 CPI添加量对猪肉肌原纤维蛋白乳液ESI的影响分析

ESI可表征加工过程中蛋白质维持乳液体系稳定不分层的能力[27]. CPI添加量对猪肉肌原纤维蛋白乳液ESI的影响如图2所示. 由图2可以看出，未添加CPI的肌原纤维蛋白乳液，其ESI指数为33.2%. 随着CPI添加量的增加，肌原纤维蛋白乳液的ESI指数逐渐升高(P<0.05)，当CPI添加量为0.9%时达到最大值，为94.41%，此时的ESI指数与CPI添加量为0.6%和1.2%的组别之间无显著差异(P>0.05)，且3个处理组乳液的ESI指数均显著高于未添加CPI组. 这表明添加CPI能够显著提升猪肉肌原纤维蛋白乳液的稳定性，并在CPI的添加量为0.6%～1.2%时ESI指数相对较高且稳定.

2.4 CPI添加量对猪肉肌原纤维蛋白乳液流变特性的影响分析

CPI添加量对猪肉肌原纤维蛋白乳液储能模量G′的影响如图3所示. 由图3可以看出，在30～50 ℃时，所有处理组乳液的流变储能模量G′均随温度的升高而逐渐缓慢增大，然后迅速增大，并在52～54 ℃达到最大值. 随后，G′急剧下降，并在61 ℃时降到最小. 之后，G′再次随温度的升高而逐渐增大. 与未添加CPI组相比，猪肉肌原纤维蛋白乳液的G′随着CPI添加量的增加而增大，且在CPI添加量为1.2%时达到最大值. 这表明添加CPI能提升猪肉肌原纤维蛋白乳液热诱导形成的凝胶的保水能力，且能提升猪肉肌原纤维蛋白乳液的凝胶强度，使其形成更稳定的乳化凝胶网络.

图3 CPI添加量对猪肉肌原纤维蛋白乳液储能模量G′的影响Fig.3 Effect of CPI addition on storage modulus (G′) of pork myofibrillar protein emulsion

2.5 CPI添加量对猪肉肌原纤维蛋白乳液总体稳定指数的影响分析

总体稳定指数可以快速、简便地表征样品的稳定性，而近红外脉冲光源可以快速分析半液态、液态溶液等分散体系的乳化现象. 分散相粒子的体积分数和平均粒径可影响散射光强度的变化程度，决定体系的稳定程度，总体稳定指数曲线越低表明体系的总体稳定性越好[28]. CPI添加量对猪肉肌原纤维蛋白乳液总体稳定指数的影响如图4所示. 由图4可以看出，随着CPI添加量的增加，猪肉肌原纤维蛋白乳液的总体稳定性逐渐升高，当CPI添加量为1.2%时，总体稳定指数最小，即乳液体系稳定性最好，这与ESI分析结果一致，表明添加CPI能提升猪肉肌原纤维蛋白乳液的稳定性.

图4 CPI添加量对猪肉肌原纤维蛋白乳液总体稳定指数的影响Fig.4 Effect of CPI addition on total stability index of pork myofibrillar protein emulsion

2.6 CPI添加量对猪肉肌原纤维蛋白乳液乳析指数的影响分析

新制备的乳液在静置过程中，会随着时间的推移而出现絮凝、聚集甚至乳化分层的现象，这与乳液的稳定性密切相关. 乳液可分为上下两层，顶层为乳化层，底层为水层，分层越明显表明乳液体系的稳定性越差[29]. 乳析指数反映了乳液中油滴聚集和絮凝的程度，乳析指数越小，乳液越稳定[30]. CPI添加量对猪肉肌原纤维蛋白乳液乳析指数的影响如图5所示. 由图5可以看出，随着CPI添加量的增加，乳析指数逐渐减小(P<0.05)，当CPI添加量为1.2%时，猪肉肌原纤维蛋白混合乳液的乳析指数最小，为2.9%，且显著低于未添加CPI组(P<0.05)，该结果与ESI及总体稳定指数分析结果一致. 这表明添加CPI能提升猪肉肌原纤维蛋白乳液的稳定性.

图5 CPI添加量对猪肉肌原纤维蛋白乳液乳析指数的影响Fig.5 Effect of CPI addition on creaming index of pork myofibrillar protein emulsion

3 结论

本文研究了添加不同质量分数的CPI对猪肉肌原纤维蛋白乳液的EAI、ESI、流变性能等乳化特性的影响，结果表明：添加CPI可以显著提高猪肉肌原纤维蛋白乳液的EAI和ESI；随着CPI添加量的增加，猪肉肌原纤维蛋白乳液的流变储能模量G′逐渐升高，总体稳定指数曲线逐渐降低，当CPI添加量为1.2%时，猪肉肌原纤维蛋白乳液的G′最大，总体稳定指数和乳析指数均最小，乳液最稳定.该研究结果表明添加CPI能改善猪肉肌原纤维蛋白的乳化特性，在肉制品加工中具有广阔的应用前景.