产香菌株的分离鉴定及其发酵产物在卷烟加香中的应用

闫洪洋，黄启蒙，蔡兴华，张立立，徐志强，马林，李萌

1.中国烟草总公司职工进修学院, 河南 郑州 450008;

2.郑州轻工业大学 食品与生物工程学院， 河南 郑州 450001;

3.浙江中烟工业有限责任公司 技术中心, 浙江 杭州 310024

0 引言

烟用香料是卷烟生产中必不可少的物质，对卷烟的风格和品质形成有重要影响. 烟用香料主要包括烟草源香料、非烟草来源的天然香料和人工合成香料[1-2]. 然而，天然香料资源有限，难以满足市场需求；合成香料香气单一，受合成方法或条件的制约，很多优质香气成分尚不能人工合成，或合成成本太高[3-5].

随着微生物发酵技术的不断发展，利用微生物发酵技术制备烟用香料成为行业内的研究热点. 该方法制备的烟用香料具有不受气候条件限制、生产周期短、对环境友好等特点[6]. 但是，目前将微生物发酵技术应用于烟用香精香料开发的报道主要集中于陈化后烟叶表面微生物的利用与开发[7-8]. 吕品等[9]利用由自然陈化的白肋烟叶分离筛选的产香菌发酵咖啡，定向生产了具有独特香气特征的烟用香料，卷烟加香实验结果表明：发酵香料具有提高卷烟烟气香气质、增大香气量、降低干燥感和刺激性、柔和烟气等作用. 庹有朋等[10]应用高通量测序分析了陈化烟叶表面微生物种类并从中筛选出优势株菌应用于烟叶发酵，发酵后烟叶的香气质和香气量增加，刺激性、杂气减少，烟叶品质明显提升.

目前，果类微生物在烟用香料制备中的应用也有相关报道，周丽娟等[11]从荔枝中分离得到的内生酵母菌能够发酵产生苯乙醇、糠醛、2,3-丁二醇等香气物质；朱宇等[12]从西瓜中分离的一株内生酵母菌能够将苯、胺、酚等物质转化生成酸、醇等香气物质，将由其发酵干果提取液制备的香料加入卷烟中，具有柔和烟气、提高烟气细腻性和甜润感的作用. 郭林青等[13]从巨峰葡萄表皮分离筛选得到一株能够使烟末发酵液产生明显花香韵和甜香韵且区别于对照组的汉逊酵母菌株YG-4，利用该菌株发酵制备得到的烟末发酵液与空白对照组对比，虽然有部分香气成分含量降低，但是苯乙醇、苯甲醛苯乙酯、2-戊烯酸、1-苯基-3-氨基吡唑含量均有所增加，对于发酵液香味有所改善，产生不同于空白对照组的特征香气.

为开发与以往研究不同的微生物资源，本研究拟从阳光玫瑰葡萄中分离筛选出产香菌株，并对其进行形态学、分子生物学鉴定；利用所得菌株发酵烟末，制备出能够赋予卷烟独特风格特征的烟用香料，以改善卷烟的吸食品质，为生物发酵技术在烟用香料开发中的应用提供参考.

1 材料与方法

1.1 实验原料与试剂

原料：临沧C3F复烤烟叶，河南中烟工业有限责任公司技术中心提供；阳光玫瑰葡萄，摘自郑州大学葡萄园，采集3个样品用于3次重复实验，分别标记ZD1、ZD2、ZD3，在无菌条件下收集3个新鲜样品的葡萄表皮用于实验.

试剂：Ezup柱式酵母基因组DNA提取试剂盒，生工生物工程(上海)股份有限责任公司产.

1.2 主要仪器与设备

EL204型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司产；HZQ-211C型落地恒温振荡器、HWS-12型电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司产；LX-C35L型压力蒸汽灭菌锅，合肥华泰医疗设备有限公司产；SW-CJ-2D型无菌操作台，苏州净化设备有限公司产；SHL-D(Ⅲ)型循环水式真空泵，郑州凯鹏实验仪器有限公司产；SHSL型调温电热套，天津泰斯特仪器有限公司产；GC6890-5973MSN型气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦科技公司产；RE-52AA型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂产.

1.3 培养基的配制

YEPD培养基：蛋白胨2 g，酵母浸粉1 g，葡萄糖2 g，琼脂粉2 g，蒸馏水定容至100 mL，于115 ℃下高温高压灭菌30 min.

WL鉴定培养基：酵母浸粉4 g、蛋白胨5 g、葡萄糖5 g、磷酸二氢钾0.55 g、氯化钾0.425 g、氯化钙0.125 g、硫酸镁0.125 g、氯化铁0.002 5 g、硫酸锰0.025 g、溴甲酚绿0.022 g、琼脂20 g，蒸馏水定容至1000 mL，于115 ℃下高温高压灭菌30 min.

发酵培养基：烟末(C3F复烤烟叶经粉碎打末)10 g，蒸馏水100 mL，于115 ℃下高温高压灭菌30 min.

1.4 实验方法

1.4.1 菌株的富集、分离及纯化参考张俊杰等[14]的研究方法，简述如下：在无菌条件下，分别取1 g葡萄果皮样品加入到99 mL无菌液体YEPD培养基中，于30 ℃、180 r/min条件下振荡培养48 h，取出静置，将富集液进行梯度稀释至10-5. 分别选取稀释度为10-3、10-4、10-5的稀释液均匀涂布至固体YEPD培养基，在30 ℃恒温箱内培养2～3 d至长出单菌落. 采用平板划线法纯化菌株，编号保存.

1.4.2 产香菌株的筛选将保存的菌株接种至液体YEPD培养基，振荡培养，培养过程中观察并记录发酵液香味变化，通过嗅辨分析将产生令人愉悦香气的菌株培养液取出、标记，并编号保存[15]. 方法简述如下：按1∶10(体积比)接种量将保存菌株接入液体发酵培养基中，于30 ℃、180 r/min条件下振荡培养1～2 d，制得发酵液. 同时，同比例接种无菌水到液体发酵培养基，作为空白对照组，并设置3组平行实验. 根据感官嗅辨结果，选出产香效果较好的菌株，将明显区别于对照组香味的发酵液取出、标记. 对筛选得到的最优菌株，重复上述步骤制备发酵液，并设置空白对照组，进行菌株的鉴定及发酵液致香成分分析.

1.4.3 产香菌株的鉴定1)形态学鉴定. 将筛选得到的菌株接入WL鉴定培养基进行菌落形态观察：从菌落的颜色、质地、表面、菌落形态等特征进行描述，对酵母菌进行形态学方面的初步分类. 细胞显微形态观察：从细胞形状、细胞生殖方式和细胞为单生、对生或群生3个方面对筛选菌株进行描述[13,16].

2)分子生物学鉴定. 用酵母基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，使用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行5.8 S-ITS区基因扩增[17-18]. 对扩增后的PCR产物进行测序分析，测序结果在NCBI上进行BLAST比对，并用MEGA7软件进行分析，确定该酵母菌株的分类地位[19-22].

1.4.4 发酵液致香成分的测定样品前处理：将供试菌株种子液按1∶10的体积比接种至发酵培养基，于30 ℃、180 r/min条件下振荡培养3 d，将烟末发酵液置于同时蒸馏萃取装置一端的圆底烧瓶中，加入25 g氯化钠，溶解于100 mL蒸馏水，用电热套加热；装置的另一端为盛有60 mL二氯甲烷.二氯甲烷萃取液加入适量的无水硫酸钠进行干燥，置于4 ℃过夜的500 mL圆底烧瓶，在60 ℃下水浴加热，同时蒸馏萃取3 h. 过滤，加入1 mL乙酸苯乙酯作为定量分析的内标物质，将滤液减压浓缩至1 mL，待测. 每个样品做3次重复实验.

GC测试条件：毛细管柱HP-5 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样温度240 ℃；载气He，流速1.0 mL/min；分流比5∶1；进样量1 μL；升温程序50 ℃，保持2 min，以4 ℃/min速度上升到280 ℃，保持10 min，结束. MS测试条件：传输线温度280 ℃；EI电子能量70 eV；倍增器电压1450 V；质量扫描范围35～550 amu；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃.

采用NIST14.L质谱数据库进行检索，将检测出的化合物的结构特征与图谱进行比对，并采用峰面积归一化法定量计算烟末发酵液中主要特征香气成分的含量.实验设置3次重复.

1.4.5 烟用香料的制备将供试菌株种子液按1∶10的体积比接入发酵培养基，于30 ℃、180 r/min条件下置于摇床发酵2 d，制备发酵液. 同时，同比例接种无菌水到发酵培养基，作为空白对照组.发酵结束后，在发酵液中加入2倍量体积分数为75%的乙醇加热回流提取，重复操作，收集两次的提取液，过滤，滤液静置后取上清液，用旋转蒸发仪(60 ℃)蒸馏除去乙醇，制得烟用香料.

1.4.6 卷烟加香评价按烟丝质量分数分别为0.01%、0.05%、0.10%、0.15%称取烟用香料，用5 mL纯净水溶解后用微量喷雾器均匀地喷加于100 g烟丝上，以纯净水为空白对照，均置于温度(22±1) ℃和相对湿度(60±2)%环境中平衡48 h，制成卷烟.采用整体循环法，经专业评吸小组对上述卷烟进行感官综合描述，感官评吸按照卷烟感官品质评判标准，以香气质、香气量、杂气、刺激性、劲头、余味为主要指标进行判断[23].

2 结果与分析

2.1 菌株分离筛选结果

本研究从阳光玫瑰葡萄果皮表面共分离得到23株酵母菌，通过嗅辨评定，所得发酵液与空白组进行对照，仅菌株MG6发酵液具有浓郁的果香味，并略带酒香气息.

2.2 产香菌株鉴定结果

2.2.1 形态学鉴定MG6在WL培养基上的菌落形态特征和显微形态特征如图1和图2所示. 由图1可知，产香菌株MG6在WL培养基上，菌落颜色呈白色边、浅绿色顶，菌落形态均为中部凸起、表面褶皱、无光泽、干燥、不透明、边缘不规则. 由图2可知，在显微镜下，MG6菌株细胞形态呈椭圆形，单生，单端芽殖.

图1 MG6在WL培养基上的菌落形态特征Fig.1 Colony morphology of MG6 on WL medium

图2 MG6的显微形态特征Fig.2 Micromorphological characteristics of MG6

2.2.2 分子生物学鉴定菌株MG6的5.8S-ITS扩增电泳图如图3所示. 由图3可知，MG6菌株的5.8S-ITS序列PCR产物电泳条带明亮清晰且无拖带现象，序列长度在400 bp左右，符合测序要求.

图3 菌株MG6的5.8S-ITS扩增电泳图Fig.3 PCR product of 5.8S-ITS of strain MG6

将测序得到的基因序列经过修正后提交到Genebank,并利用NCBI数据库中的BLAST工具进行序列比对.利用Mega 7.0软件，用K2+G模型进行Maximum Likehood(ML)聚树及系统发育分析，基于5.8S-ITS序列的系统发育树如图4所示. 由图4可知，菌株MG6与Pichiaterricola、Issatchenkiaterricola聚为同一分支，遗传相似性为100 %. 多重序列分析已将伊萨酵母属(Issatchenkia)归入毕赤酵母属(Pichia)[24-26]，可将Pichiaterricola和Issatchenkiaterricola认定为同一种菌，即陆生毕赤酵母(Pichiaterricola)[27]. 因此，确定菌株MG6为Pichiaterricola.

图4 基于5.8S-ITS序列的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree based on 5.8S-ITS sequences

2.3 发酵液致香成分分析结果

发酵液致香成分分析结果见表1. 由表1可知，发酵组与对照组共检测出致香成分48种，主要由酮类、醇类、酯类、酚类、烯烃类、杂环类组成. 其中对照组共检测出32种致香成分，发酵组检测出38种致香成分. 对比分析可得，发酵组酮类、醇类、酯类、酚类、烯烃类、杂环类致香成分含量相比对照组均有所增加，其中酮类致香成分增加了63.59%，醇类致香成分增加了102.28%，酯类致香成分增加了125.50%，酚类致香成分增加了77.05%，烯烃类致香成分增加了35.25%，杂环类致香成分增加了59.71%. 其中，大马士酮、巨豆三烯-3-酮、法尼基丙酮、苯甲醇、苯乙醇、二氢猕猴桃内酯、苯酚、愈创木酚、2-甲氧基-4-乙烯苯酚、新植二烯、吡啶等致香成分均有不同程度的提高.

表1 发酵液致香成分分析Table 1 Analysis of aroma components of fermentation broth

烟叶中常见的致香成分有巨豆三烯-3-酮、二氢猕猴桃内酯、新植二烯等. 其中，巨豆三烯-3-酮可有效改善烟气，增加舒适度，其增加了25.60%；二氢猕猴桃内酯具有猕猴桃样的青香果香，赋予卷烟烟气清甜味，其增加了33.07%；新植二烯能明显降低烟草刺激性、提高烤烟丰满度，其增加了32.33%. 综上所述，经产香菌株MG6发酵后，各类特征香气成分含量均明显增加，这对提高烟叶整体感官品质起到了重要作用.

2.4 卷烟加香评价结果

卷烟加香评价结果如表2所示. 由表2可知，加入适量的烟用香料，可以提高卷烟的香气质、香气量，降低刺激性，减少杂气，并使烟气柔和，改善余味. 但是，香料添加量过大会使卷烟的整体感官品质降低. 综合考虑，香料最佳添加量为0.05%.

3 结论

本研究从阳光玫瑰葡萄表皮中分离出一株能够对烟叶产香的菌株MG6，通过形态学、分子生物学鉴定，确定该菌株为Pichiaterricola. 利用GC-MS技术对其发酵液进行分析，结果表明发酵后酮类、醇类、酯类等烟叶特征香气成分含量均有不同程度的增加. 利用该菌株发酵液制备烟用香料，适量添加(添加量为0.05 %)可使卷烟香气质、香气量得到提升，刺激性、杂气降低，烟气柔和，改善了卷烟的吸食品质.

本文开发出与以往研究不同的一种新的微生物资源，并将其运用到烟叶发酵中，这对提高烟叶工业可用性具有重要意义；同时可为烟用香精香料产品的开发，以及生产特色的烟用加香原料提供一种新的思路和方法.