β-E2对大鼠低氧性肺动脉高压的改善作用

韩志富

(联勤保障部队第九四一医院，西宁 810000)

女性易发原发性肺小动脉高压 (pulmonary hypertension，PH)，具有明显的性别差异性。已有很多研究发现雌激素对肺动脉具有保护作用[1，2]，但在低氧性肺动脉高压(Hypoxic pulmonary hypertension，HPH)的发生、发展过程中，β-E2是否具有保护作用尚未定论。本研究拟明确β-E2对大鼠HPH的相关作用及可能作用机制。

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

成年雄性SD大鼠(体重：150±20g)购自兰州大学医学动物中心，合格证号：SYXK(甘)2018-0003。

1.1.2 仪器及试剂

JY92-II超声波细胞粉碎仪购自宁波新芝生物仪器公司；RPMI 1640培养液购自美国Hy-Clone公司；Eppendorf-5430型台式超高速低温离心机购自德国Eppendorf公司；莱卡RM224-5型石蜡切片机购自德国莱卡生物仪器公司；Motic SMZ140解剖显微镜购自香港MOTIC公司；ZTE-202型恒温干燥箱购自上海器特仪器有限责任公司；M-MuLV反转录试剂盒购自英国Invitrogen公司；琼脂糖及嗅化乙锭(EB)购自美国Amresco公司；β-E2购自美国SA公司；DNA Ladder Marker 2000购自西安舟鼎生物试剂有限责任公司；酶标仪购自美国POWERWAVE公司；GeneAmp 9700型RT-PCR仪购自美国Life Technologies公司；Biosens SC810型凝胶成像系统购自上海Biosens公司；PowerPac Basic电泳仪购自美国Bio-Rad公司。抗大鼠P27kip 1抗体购自美国Millipore公司；抗大鼠Skp-2抗体购自英国Abcam公司；抗大鼠AKT-P抗体购自美国Ce1lSignaling公司；抗大鼠p-actin抗体购自美国Sigma-Aldrich公司；HRP标记的山羊-抗鼠二抗及商品化免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物试剂有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组

1.2.1.1 实验动物分组

将约200 g的成年雄性SD大鼠随机分为常氧组和低氧组。常氧组大鼠置常氧动物室中(大气压强约580mmHg，PO2为120mmHg，O2浓度约为18%)中饲养；低氧组大鼠置低压低氧舱(大气压强约为380mmHg，PO2为79.6mmHg，O2浓度约为10%)中饲养。

1.2.1.2 细胞培养分组

实验分常氧组(Normoxia)、低氧组(Hypoxia)、β-E2干预组(10-5、10-7、10-9mol/L)。

1.2.2 大鼠PASMCs原代培养与鉴定

取各组大鼠原代肺小动脉平滑肌细胞行细胞贴壁法培养。一周后在显微镜下可见肺小动脉组织周围有呈梭形的肺动脉平滑肌细胞生长(图1 A )，且融合生长的原代PASMCs在对数期的细胞呈长梭形，且细胞形态较整齐、透光性良好，细胞群在对数期内都呈现涡旋状分布 (图1B )。通过a-SM-actin免疫荧光染色发现多数肺动脉平滑肌细胞荧光染色为深红色，表达为阳性(+)，说明本次培养的细胞就是肺小动脉平滑肌细胞，而且阳性率高达95%以上(图1a )。

(A)PASMCs grew from lung arterial explants；(B)Confluence PASMCs(×100)(a)Fluorescence staining of a-SMA in rat PASMCs(×400)；(b)Hoechst Staining of cell PASMCs；(c)Mix picture of(a)/(b)

1.2.3 平滑肌细胞增殖实验

将对数生长期的肺小动脉平滑肌细胞用胰蛋白酶消化混匀后，按4×104个/孔的浓度接种在96孔板中，运用血清饥饿法诱导细胞同步分裂，即先行饥饿培养48 h，再加入1640培养液(含有5%血清)和不同浓度的β-E2培养，在常氧条件和低氧条件下进行细胞原代培养。培养48 h后分别加入MTT(5mg/mL)继续培养4 h，再加入DMSO(每孔150μL)震荡10 min，在490 nm波长处检测吸光度值。

1.2.4 检测

1.2.4.1 Western Blot实验

在1.2.3的实验中，收集细胞后提取总蛋白，用Western Blot检测Skp-2、P27kip1的蛋白表达水平。

1.2.4.2 RT-PCR实验

在1.2.3的实验中，收集细胞提取RNA后进行PCR扩增，检测P27kip1、Skp-2的mRNA表达水平。

1.2.5 统计学分析

统计分析使用SPSS 21.0软件，分析各组数据间的差异性选用方差分析法，多组间的差异比较采用LSD法，视P<0.05为有统计学差异。

2.结果

2.1 β-E2对低氧环境所诱导肺小动脉平滑肌细胞增殖的影响

图2显示，较常氧组，低氧组肺动脉平滑肌细胞数增加了约1.5倍，说明低氧可以明显刺激肺动脉平滑肌细胞增殖。β-E2干预组的肺动脉平滑肌细胞增殖量显著低于低氧组，β-E2浓度为10-5mol/L时，较低氧组细胞增殖数量减少了43%，说明β-E2的干预有效减少了低氧肺动脉平滑肌细胞增殖量。

*：P<0.01，vs normoxia group.#：P<0.01，vs hypoxia group.Values are expressed as

2.2 β-E2对肺小动脉平滑肌细胞Skp-2、P27kip1表达的影响

图3a显示，较常氧组，经低氧刺激的细胞的P27kip 1表达水平显著降低，Skp-2表达水平显著升高；相比低氧组，经β-E2干预后的细胞P27kip 1、Skp-2表达水平呈下降趋势。

图3b 显示，常氧组和低氧组P27kip 1转录mRNA的表达差异并不显著、Skp-2表达差异显著，说明低氧刺激对P27kip 1的表达水平未产生明显影响。即β-E2干预对P27kip 1转录的mRNA的量无显著影响，对Skp-2的表达存在影响。

2.3 β-E2对肺小动脉平滑肌细胞中的磷酸化AKT水平的影响

(a)Representative Western blotting analysis of P27kip1 and Skp-2 protein levels in rat lungs(b)Representative RT-PCR analysis of P27kip1 and Skp-2 mRNA levels in rat.*：P<0.05，vs hypoxia group.#：P<0.05，vs normoxia group

图4显示，低氧组肺小动脉平滑肌细胞中的磷酸化AKT的表达水平明显高于常氧组，而经β-E2干预后，有效降低了低氧刺激后的磷酸化AKT水平。

Representative Western blotting analysis of AKT-P protein levels in cultured rat PASMCs.*：P<0.01，vs hypoxia group.#：P<0.05，vs normoxia group.Values are expressed as mean±SD(n=3)

3.讨论

在HPH的发生发展过程中会出现肺小动脉小血管的重构，且肺小动脉血管的重构机制非常复杂，目前尚未完全阐明。已有研究发现在治疗血管性疾病时，可以把控制细胞周期作为一个重要的方法[3]。近年来P27kip1引起了很多学者的关注，作为影响细胞周期抑制因子和表达抑癌蛋白，其具有抑制癌细胞增殖和刺激血管增生的作用[4]。Diez等研究发现P27kip 1具有抑制动脉粥样硬化和血管平滑肌细胞增殖的作用[5]。由于Skp-2既是P27kip 1的降解酶，同时也是一种致癌基因蛋白，因而备受关注[6-8]。目前已经将Skp-2作为癌症及心血管疾病的治疗靶点[9-10]。本实验结果表明，经低氧刺激后，血管平滑肌细胞P27kip 1、Skp-2和磷酸化AKT的表达增多，而采取β-E2干预后，P27kip 1、Skp-2和磷酸化AKT水平都较低氧组有了明显改善，出现了表达逆转现象。因此，通过调节Skp2、P27kip1、AKT信号通路抑制肺动脉肌细胞的增殖是β-E2发挥保护作用的一个可能机制。