AKAP10基因单核苷酸多态性与青海地区病态窦房结综合征研究※

任 明，保积英，许博林，杜 娟，何 媛，Aqib Bilal

(1.青海大学附属医院心血管内科，西宁 810001；2.青海省人民医院心血管内科，西宁 810007；3.青海大学医学院，西宁 810001；4.青海大学，西宁 810016)

病态窦房结综合征(Sick Sinus Syndrome， SSS)病因及机制目前尚不完全明确，可能与窦房结细胞受损、窦房结内各种离子通道改变、窦房结组织重构等因素有关[1，2]。目前较多文献认为原发性心电异常发病机制主要是由其编码的离子通道的基因突变引起的，被称为“离子通道病”[3]。有研究指出，部分SSS的发生机制也与基因突变有关[1，4，5]。赵允梓等人认为蛋白激酶A锚定蛋白(A-kinase anchoring proteins，AKAPs)家族中的AKAP10基因与心脏传导系统关系密切[6]，并且指出AKAP10中两个单核苷酸多态性位点(rs203462和rs4925060)与窦性停搏密切相关。SSS的基因多态性研究为该病的诊治提供了新思路，有研究认为AKAP10通过调节心肌细胞对胆碱能迷走神经的敏感性来调节心率[7]。目前国内对SSS患者基因多态性的研究仅限汉族人群。青海地区世居藏族的迷走神经张力略高，致成人心率偏慢[8]，为了解青海地区汉藏族SSS的发病与AKAP10基因多态性的关系及藏族人发生SSS与汉族之间有无差异性，本研究选取青海地区汉族、藏族SSS患者及健康对照人群进行对照研究。现将有关研究情况报告如下。

1.对象与方法

1.1 研究对象

收集青海地区2018年1月至2019年12月来青海大学附属医院和青海省心脑血管病专科医院就诊的符合入选标准的人员为研究对象：汉族SSS患者60例，平均年龄62.28±9.58岁，男性31例，女性29例；藏族SSS患者35例，平均年龄64.94±7.24岁，男性20例，女性15例。并将同期来两院体检的汉、藏族健康者纳入对照组，其中藏族47例，平均年龄58.70±14.49岁，男性18例，女性29例；汉族48例，平均年龄59.67±12.33岁，男性21例，女性27例，各组间年龄、性别比较均无差异(P>0.05)，具有可比性。所有患者或家属签署了知情同意书。本研究经青海大学附属医院伦理委员会审核通过。

1.2 研究方法

1.2.1 诊断标准选择

入选标准参照《内科学》(第九版)标准：所有研究对象心电图须符合以下条件之一：1)非药物引起的持续而显著的窦性心动过缓(50次/分)，发作无明显诱因，和临床症状相关；2)窦性停搏或窦性静止与窦房阻滞；3)窦房传导阻滞与房室传导阻滞并存；4)心动过缓-心动过速综合征交替发作；5)既往诊断SSS患者并行起搏器植入治疗。

排除标准：伴有影响心脏传导功能的器质性心脏病(如风湿性心脏病、急性下壁心肌梗死病和先天性心脏病等)患者。

1.2.2 一般资料收集

记录入选研究对象的年龄、性别、身高、体重，同时采集清晨空腹状态下4 mL外周静脉血，检测总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、尿素氮(BUN)等生化指标；根据体表心电图及24小时心电监护记录判断是否合并心房颤动及左束支传导阻滞。

1.2.3 实验步骤设计

取抗凝外周静脉血2 mL→提取基因组DNA→用PCR扩增目的基因→做PCR产物纯化→制备电泳样品→做序列测定、分析。

1.2.4 实验过程设定

1.2.4.1 SNaPshot PCR引物设计与扩增、纯化

SNaPshot PCR引物见表1。

表1 SNaPshot PCR引物

扩增：使用金牌绿酶 Mix进行扩增，加入金牌绿酶Mix 45 μL、上游Primer(10P)2 μL、下游 Primer(10P)2 μL、gDNA 1 μL。

PCR反应条件：98 ℃预变性120 S；98 ℃变性10 S；60 ℃退火20 S；72 ℃延伸10 S，共35个循环；72 ℃延伸60 S后置4 ℃环境保存。

纯化：在15 μL PCR产物中加入5USAP和2UExoI，震荡混匀，置37 ℃环境保温1 h，然后置75 ℃保温15 min以灭活SAP、ExoI酶。

1.2.4.2 SNaPshot 延伸反应

取经过处理的PCR混合液各3 μL，加入5 μL SNapshot Reaction Mix、1 μL混合引物、1 μL DDH2O混合。

单核苷酸延伸：96 ℃变性10 S，50 ℃退火5 S；60 ℃延伸30 S，共25个循环。置4 ℃环境保存。

电泳样品制备：加入上述SNaPshot 0.5 μL、高度去离子甲酰胺9.25 μL、GS-120 LIZ 0.25 μL，95 ℃变性5 min，迅速冰冷4 min。

1.2.4.3 序列测定、分析

光谱校正：将Hi-Di甲酰胺350 μL、Matrix标准品50 μL混合，95 ℃变性5 min→迅速冰冷5 min，平分2管，每管200 μL。分装至上机板后对3730XL DNA Analyzer进行光谱校正。

毛细管电泳检测及数据分析：使用3730XL DNA Analyzer仪对制备好的样品进行毛细管电泳并搜集信号。环境温度：18 ℃～25 ℃，毛细管长度：50 cm，加热炉温度：60 ℃，运行电压：15 KV。使用GeneMapper V4.0软件分析实验数据，结果使用Sanger软件测序校正。

1.2.5 统计学处理

2.结果

2.1 各组一般临床资料比较情况

比较各组研究对象一般临床资料的差异，分析结果显示：部分组间合并房颤差异有统计学意义；BMI、TC、LDL及BUN水平在各组间均无统计学差异(P>0.05)，其中，两两比较分析结果显示：1)汉族SSS组与汉族对照组：合并房颤的组间差异具有统计学意义(P<0.05)；2)藏族SSS组与藏族对照组：合并房颤的组间差异具有统计学意义(P<0.05)；3)汉族对照组与藏族对照组间均无统计学意义(P>0.05)。见表2～3。

表2 各组一般资料

表3 各组一般资料(%)

2.2 各组基因型Hardy-Weinberg检验结果

对各组rs203462基因型行遗传平衡的Hardy-Weinberg检验，分析结果显示：藏族SSS组：χ2=1.033，P>0.05；藏族健康对照组：χ2=2.343，P>0.05；汉族SSS组：χ2=1.285，P>0.05；汉族健康对照组：χ2=0.486，P>0.05，藏、汉族SSS组、正常组的研究对象均符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明入选人群符合遗传平衡，具有代表性。

各组rs4925060基因型行遗传平衡的Hardy-Weinberg检验，分析结果显示：藏族SSS组：χ2=0.990，P>0.05；藏族健康对照组：χ2=0.535，P>0.05；汉族SSS组：χ2=0.413，P>0.05；汉族健康对照组：χ2=0.326，P>0.05，藏、汉族SSS组、正常组的研究对象均符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明入选人群符合遗传平衡定律，具有代表性。

2.3 汉、藏族不同位点SSS组与正常组间比较各基因型及等位基因频率

分别比较汉、藏族SSS组与对照组在两个位点rs203462和rs4925060的CC、CT、TT基因型及C、T等位基因频率，CC、CG、GG各基因型及C、G等位基因频率的差异用χ2检验，分析结果显示，rs203462位点：1)汉族SSS组与藏族SSS组基因型及等位基因的频率的差异无统计学意义(P>0.05)；2)藏族SSS组与藏族对照组基因型及等位基因的频率的差异有统计学意义(P<0.05)；3)汉族SSS组与汉族对照组基因型及等位基因频率的差异无统计学意义。rs4925060位点：1)汉族SSS组与藏族SSS组基因型及等位基因的频率的差异均无统计学意义；2)藏族SSS组与藏族对照组基因型及等位基因的频率的差异均无统计学意义；3)汉族SSS组与汉族对照组基因型及等位基因频率的差异亦无统计学意义。见表4～5。

表4 汉族和藏族SSS rs203462基因型和等位基因(%)

表5 汉族和藏族SSS rs4925060基因型和等位基因(%)

3.讨论

心律失常是当今各个国家死亡的主要原因之一，每年有40万到46万美国人死于心律失常引起的猝死[7]。对于SSS的发病率报道不一，从22%～45%不等[9]。目前关于SSS遗传学方面的发病机制已成为研究热点，国内外学者在动物及人体研究中发现遗传基因的突变是导致SSS的主要因素之一[10-15]，如Klotho基因G395A位点多态性与SSS发病相关。AKAPs属于与蛋白质激酶A(PKA)结合的支架蛋白家族，在交感系统兴奋的情况下，活化的 PKA可以磷酸化一系列参与调节电活动性和收缩性的蛋白质，AKAPs是其中一员，参与调节 cAMP/PKA的活性和细胞内的Ca2+信号，进一步调节心脏的功能。赵允梓等人[6]证实AKAP10中两个单核苷酸多态性位点rs203462和rs4925060与窦性停搏相关。我们的研究结果提示，AKAP10中rs203462位点在藏族SSS组及对照组中具有显著差异，T等位基因的频率明显高于藏族健康对照组，携带T等位基因可能会增加SSS的易感性。Kammerer等人发现，1936A→G AKAP10转换(rs203462)，即第646位氨基酸由异亮氨酸(Ile)变为缬氨酸(Val)，进而改变AKAP10与 PKA 调节亚单位 RI alpha (PKA-RIα) 的结合，进而对心脏离子通道或交换器的磷酸化状态产生显著影响，导致心脏功能障碍[16]。有研究认为，1936A→G，这种转变与心率变异性和长QT间期有关，同时与心律失常、血压变化也有关[9，17，18]。研究者发现AKAP10的I646V(A to G)多态性与老年人群心电图中PR间期的变化有关，并且报道了老年人群中的纯合子缬氨酸变异体的PR间期明显低于异亮氨酸纯合子个体的PR间期。在AKAP10突变的老鼠模型中，用ECG记录发现窦性心动过缓(P-P间期延长)和房室传导减慢(P-R间期延长)两种缓慢型的心律失常[19]，并证实了这种突变与胆碱能迷走神经敏感性增高有关。以上研究结果均说明rs203462变异与SSS的发生有显著关系，与我们的研究结果一致。藏族人群本身迷走神经活性高致心率偏慢，再加上研究证实AKAP10突变体具有更强的压力感受反射性，所以藏族SSS的发生可能与这两者有关。

我们的研究结果显示，AKAP10基因rs4925060位点的多态性与汉、藏族SSS的发病无关。另外我们的研究结果显示，AKAP10单核苷酸多态性rs203462和rs4925060位点基因型与等位基因频率在汉族SSS与藏族SSS间无差异，Tingley等人在研究中发现AKAP10突变体I646V在改变心率的研究中发现这种改变不存在种族、性别、年龄等差异[8]，这与我们的研究结果一致。

本研究比较汉、藏族SSS组与健康对照组一般临床资料的差异，比较结果显示：合并房颤(Af)可能与SSS的患病相关。SSS组较健康对照组更易合并房颤的发生，有研究发现在快速起搏构建的Af模型中窦房结功能及窦房传导功能出现明显障碍，此外Af还会导致心房及窦房结纤维化最终导致SSS的发生与发展[20]。刘赛哲等人明确指出，Af是SSS的主要危险因素[21]。由此可见心房颤动既是SSS的重要危险因素，同时也是常见并发症。本研究仅仅统计了SSS合并房颤的情况，两者之间的因果关系有待进一步研究。

综上所述，青海地区汉、藏族间AKAP10单核苷酸多态性位点rs203462及rs4925060基因多态性无差异性，但AKAP10基因rs203462T/C多态性可能与藏族人群的SSS发生有关，携带T等位基因可能会增加藏族人群SSS罹患风险，但与汉族无关。本研究结果为青海地区提高SSS患者的诊治水平提供了新的思路。