高原低氧下机体铁代谢变化及其对红细胞生成的影响※

李美琦综述 骆倩倩审校

(南通大学特种医学研究院低氧生物医学综合实验室，江苏 南通 226019)

高原红细胞增多是一种典型的慢性高原病，特点是红细胞的大量生成及累积。铁是红细胞合成的重要原料，在正常情况下机体的铁稳态处于平衡状态，但是在高原低氧环境下，铁代谢发生明显改变，机体铁稳态被打破并显著影响红细胞生成。本文围绕低氧对机体铁代谢的影响和高原低氧下机体铁代谢的变化对红细胞生成的影响进行综述。

1.高原低氧的适应

缺氧诱导因子(Hypoxia inducible factor，HIF)是氧稳态的主要调节者，也是诱导低氧基因和修复细胞内氧环境的核心调节因子[1]。HIF是由受氧浓度诱导型表达的HIF-α亚基和组成型表达的HIF-β亚基组成的异源二聚体[2]，其中HIF-α有3个亚型(HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α)并分别由三个独立的基因(HIF1A、EPAS1和HIF3A)编码，HIF-β只有一种亚型。HIF-1α和HIF-2α以不同的方式与DNA结合，参与红细胞生成的途径的调控。通常认为HIF-1α参与急性缺氧反应而HIF-2α参与慢性缺氧反应。目前关于HIF-3α的研究较少。在常氧条件下，脯氨酰羟化酶(Prolyl hydroxylase，PHD)可以将氧气、亚铁和α-酮戊二酸作为底物，在氧依赖性降解域内对HIF-α亚基进行羟基化，羟基化的HIF-1α被pVHL识别，随后募集E3泛素连接酶对其复合物进行泛素化[3]，最后经过蛋白酶体降解途径被降解[4]。在低氧环境中，PHD处于抑制状态，HIF-α可与细胞质中的热休克蛋白90结合使HIF-α稳定，经过HIF-α的C端的核定位信号的协助，使其转移至细胞核内，与HIF-β形成异源二聚体发挥转录因子调节功能。当HIF结合到靶基因低氧反应原件(HRE)上时，募集转录共激活因子CBP/p300来激活相关靶基因[包括促红细胞生成素(EPO)[5]]刺激骨髓生成新的红细胞；增加血管内皮生长因子的表达，促进血管生成增加供血；增加无氧酵解过程中相关基因(PDK1、LDHA、GLUT1等)的表达，以对低氧作出适应性反应[6]。PHD具有3个亚型，其中PHD1主要位于细胞浆，PHD2主要位于细胞核，而PHD3在胞浆和胞核都存在。PHD作为HIF-α氧传感器的调节剂，其活性也受细胞内氧浓度的控制。

虽然高海拔低氧环境容易导致高原病的发生，然而一些久居高原人群却对高原环境表现出了独特的适应性。研究表明藏族人群特有的HIF-2α(又称EPAS1)[7]、PHD2(又称EGLN1)[8]和血红素加氧酶2(HMOX2)[9]基因均有不同于汉族人群的突变，正是这些遗传基因的突变阻止了藏族人血红蛋白浓度的过度升高，降低了各种高原性疾病发生的可能性。但无论是EPAS1、EGLN1，还是HMOX2，都是通过降低藏族人血液中的血红蛋白的量来使藏族人适应低氧环境。而急进高原者或移居者在这些基因没有发生突变的情况下是如何适应高原低氧环境的具体机制尚不清楚。

2.高原低氧对铁代谢的影响

在高原低氧暴露时，机体正是通过调节或影响铁调素(Hepcidin，Hepc)、铁输出蛋白(Ferroportin，Fpn)、转铁蛋白(Transferrin，Tf)、转铁蛋白受体(Transferrin Receptor，TfR)、铁蛋白(Ferritin，Ft)、二价金属离子转运体1 (Divalent metal transporter l，DMT1)这些铁代谢相关蛋白的表达实现对机体铁代谢稳态的调节，从而保证高原暴露情况下新的血红蛋白生成对铁的需求。

2.1 高原低氧对Hepc的影响

Hepc是由肝脏合成并分泌的富含半胱氨酸的25个氨基酸的抗菌多肽，以抑制铁超载或炎症来调节全身铁稳态。它可以影响肠道铁吸收、巨噬细胞铁释放以及肝脏铁存储。Hepc的主要作用方式是通过结合其受体蛋白——膜铁转运蛋白Fpn来实现的。Hepc与细胞膜上的Fpn结合可引起Fpn内化，形成内吞小体后与溶酶体融合并在其中被降解[10]。在巨噬细胞、肠上皮细胞和肝细胞中Fpn的表达量很丰富，因此在这些细胞中Hepc的调节作用最为显著。Hepc正是通过调节这三个组织部位的Fpn的量来调节机体中的铁稳态。机体在发生应激红细胞生成和缺氧、生长、妊娠等条件下，通过抑制Hepc的生成，促进外周铁增加以满足机体对铁的需求[11]。低氧下的相关研究表明，HIF-1α可以通过直接与Hepc的启动子结合来抑制Hepc的表达[12]。后来又有研究指出，在缺氧条件下由于红细胞生成的增多引起红铁酮(EFRE)的表达增多，而EFRE可以抑制Hepc的产生，当体内铁充足时，红细胞的生成速度不受影响，红细胞数量增多，未成熟的红细胞生成并分泌EFRE以抑制Hepc，使Fpn正常释放储存铁，以供应红细胞的生成[13]。另外，HIF-2α也被证明可以通过促进EPO的表达致红细胞数增多来抑制Hepc的表达[14]。高海拔情况下，严重的能量不足也会抑制Hepc表达，但是在高原肺水肿患者中它是增加的[15]。

2.2 高原低氧对Fpn的影响

Fpn是一种含有12次跨膜结构域的蛋白，是目前已知唯一的膜结合铁输出蛋白，它的主要功能是负责将细胞内的铁从细胞内输出到细胞外。Fpn仅在几种类型细胞中表达，包括巨噬细胞、肠上皮细胞、肝细胞和乳腺上皮细胞[16]，并可将铁释放到血浆中，经过转铁蛋白的运输，参与红细胞的生成。脾脏巨噬细胞在从受损或衰老的红细胞回收铁的过程中起主要作用，并通过巨噬细胞膜表面上的Fpn将从血红蛋白上回收的铁输出至血浆中供机体循环利用[17]。因此细胞表面上的Fpn数量直接决定了铁的输出量。高原低氧对Fpn的影响主要是通过Hepc间接产生的[18]。早前的一项研究表明HIF-2α可以调节Fpn mRNA的表达，但是最近的研究证实，在小肠中，Fpn通过控制细胞铁输出调节铁依赖PHD的活性，可以稳定和激活HIF-2α[19]。

2.3 高原低氧对Tf及TfR的影响

Tf是铁的运载载体，在血浆中以三价铁结合态和未结合态形式存在[20]，游离铁一旦进入血液就会与Tf结合，通过血液将铁输送到全身各处。到达需铁的细胞后通过TfR介导摄入。TfR识别含铁Tf后，发生网格蛋白依赖性内吞，形成内吞小体，随后通过内吞小体膜上的DMT1将铁释放到细胞内，进入胞内的铁可通过Fpn输出细胞，多余的铁则被存储到铁蛋白Ft-L上[21]。通过TfR吸收与Tf结合的铁是大多数细胞中铁的主要来源[22]。但是也有研究认为，TfR还可介导Tf和H-铁蛋白(Ft-H，一种铁储存蛋白)的摄取[23]。血清Tf在肝脏、脾脏、肾脏和枢神经系统中均有合成[24]。Tf的功能对于调节胚胎生长、细胞生长、细胞凋亡、葡萄糖代谢和运动、增殖、分化至关重要。TfR的表达受细胞内铁水平的影响强烈：铁缺乏时TfR的合成被激活，充足时则相反。因此，在大多数细胞中铁的摄取水平通过调节TfR的表达实现[25]。有研究认为，TfR2/HFE复合物被认为可激活Hepcidin的转录[26]。同时，TfR2与促红细胞生成素受体(EPOR)的复合物会使细胞表面的EPOR更加稳定，而缺少TfR2会导致人类红系祖细胞的终末分化延迟，且会增加红系前体细胞的EPO敏感性[27]。另外，有研究认为HIF可通过与TfR启动子中的特定低氧反应元件结合诱导TfR基因转录。在Hep3B人肝癌细胞中，在1% O2或模拟缺氧下经CoCl2处理，TfR mRNA增加了3倍[28]，显示低氧可以诱导TfR基因的转录。

2.4 高原低氧对Ft的影响

Ft是在各组织细胞中广泛存在的主要的铁存储蛋白，对铁的稳态至关重要。Ft基因在所有动物细胞中均有表达[29]，Ft有两种亚基类型，分别为H型和L型，即Ft-H和Ft-L。这两个亚基的比例随组织类型的不同而有很大差异[30]。组织铁蛋白H亚基主要存在于心脏和肾脏中，L亚基主要存在于肝脏和脾脏中。Ft有助于正常的铁流动，当机体铁含量降低时，通过机体组织中核受体共激活因子4(NCOA4)对Ft的H亚基的识别，将Ft带入溶酶体途径降解，释放其结合的铁到胞浆再通过Fpn输出细胞供机体利用[31]。当暴露在高原低氧环境时，机体组织细胞内Ft-L的表达显著降低，以保证将其储存的铁用于造血。研究表明，低氧条件下机体产生ROS时Ft-H与Ft-L会聚集，在使用抗氧化剂后聚集作用减弱，这表明Ft-H与Ft-L的聚集可能是机体抵抗ROS的一种保护方式[32]。

2.5 高原低氧对DMT1的影响

DMT1是一种在哺乳动物中广泛表达的一种金属离子转运体，参与机体内二价金属离子的转运。食物中的铁以两种主要形式存在：血红素铁和非血红素铁，这两种形式的铁都可以被十二指肠吸收。但是大多数饮食中的非血红素铁是三价铁配合物，因此食物中的非血红素铁在达到十二指肠后，首先用肠上皮细胞顶端膜上的十二指肠细胞色素b(DCYTB)将食物中的Fe3+还原为Fe2+后，再被膜上的DMT1转入到肠上皮细胞内[33]。DMT1属于可溶性载体家族成员，由于DMT1的表达对维持全身和细胞铁稳态至关重要，因此，全身和细胞铁水平的变化均可直接或间接控制DMT1的表达。当全身性铁需求增加时，十二指肠中DMT1 mRNA和蛋白的表达增加，可促进更多的铁被吸收[34]。研究证实，低氧下DMT1表达增加的机制主要是通过HIF-1结合DMT1上的低氧反应元件促进其转录增加蛋白表达实现的。

3.高原低氧下铁代谢改变对红细胞生成的影响

低氧情况下机体对铁的需求增加，且具有一定的海拔高度和暴露时间的依赖性[35]。多项研究认为，机体在低氧下的铁代谢相关蛋白发生明显变化，如DMT1、TfR表达显著升高，Ft、Hepcidin表达显著下降[36，37]。上述结果显示，低氧下的铁稳态被打破后，铁摄取及铁转运增加，储存铁释放增加。对平原正常人群的研究发现，在刚进入高原的早期，肠道内的铁吸收增加，之后红细胞数量增加，在6个月之后，铁的利用率依旧很高；对高原世居居民的研究发现，他们对铁的利用率比平原正常人群高约30%，当人们从高原转移到平原后铁的利用率明显下降[38]。这提示铁的利用率与红细胞生成关系密切。研究二十五位健康的登山者的血清发现，高原暴露后的血清Hepc水平降低、十二指肠铁吸收及运输上调[39]。另外，由于Tf、Fpn、DCYTB铁调节蛋白(IRPs)等铁代谢相关基因上均含有HRE，在低氧引起HIF增加后这些铁代谢相关蛋白基因表达均有明显增加[40]。

机体内铁的含量显著影响红细胞的生成，红细胞在骨髓中分化时通过TfR介导的Tf的内吞作用摄取铁供应血红蛋白合成。红细胞在生成期间TfR表达持续增加，但在网状细胞释放后被下调，在成熟红细胞中则检测不到TfR。Tf的缺失可抑制EPO生成，导致储存器官中的铁积累，这表明红细胞发育成熟中需要TfR介导的铁摄入，Tf与TfR在EPO生成中至关重要。

有研究表明，当给予HIF稳定剂二甲基草酰甘氨酸(DMOG)时，能够诱导巨噬细胞由M1型向M2型转变[41]，而在低氧后巨噬细胞也表现出相同的变化[42]。虽然众所周知M1型被认为是促炎型巨噬细胞，M2型被认为是抑炎型巨噬细胞。但是研究发现M2型巨噬细胞可以诱导HMOX1的表达并上调Fpn，使血红素的氧化降解加快，促进衰老红细胞的清除并促使铁有效的被循环利用[43]。提示，低氧可能通过诱导巨噬细胞表型的转变而对铁的回收再循环利用产生重要影响。近期还有研究表明，低氧刺激致HIF被激活，有利于巨噬细胞对亚马逊利什曼原虫的吞噬[44]，随后另一项研究也得到了相同的结论[45]。然而也有研究表明，在高原低氧条件下，小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力是下降的[46]。这其中的差异可能源自不同的低氧条件。低氧暴露是否影响了巨噬细胞的活性或数量目前尚不清楚。

近年来研究人员发现了一种新的细胞死亡方式—铁死亡，这是一种以大量铁离子累积为特点的新型细胞死亡方式，在铁和酶的催化下，细胞膜上的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化可诱导细胞发生铁依赖性死亡[47]。有研究表明在低氧环境下人体活性氧族(ROS)、丙二醛(MDA)水平增加，与铁死亡相关的蛋白变化明显[48]。另外研究还发现，在低氧条件下，肺泡巨噬细胞的超氧化物歧化酶(SOD)总量明显上升，且巨噬细胞由M1向M2型转变[49]；骨髓间充质细胞在给予去铁胺(DFO)螯合铁后，HIF-1α/环氧化酶2(COX-2)通路被激活，巨噬细胞也会由M1型向M2型转变[50]。由骨髓巨噬细胞定向诱导为M2型巨噬细胞后，在低氧条件下其SOD1、SOD2和HMOX1及谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)水平均呈明显下降趋势，复氧时有所回升。这提示低氧会引起M2型骨髓巨噬细胞的抗氧化能力降低，组织巨噬细胞在处理回收铁后，由于胞内增加的铁含量和抗氧化力的降低，极易诱发铁依赖性的铁死亡。但高原低氧暴露后组织巨噬细胞是否发生铁死亡及其对红细胞的生成及清除能力的影响还有待进一步深入探究。虽然目前对于高原低氧是如何致巨噬细胞功能改变并引起铁代谢改变的机制尚不清楚，但可以明确的是，在高原低氧状态时巨噬细胞功能发生了改变，这些改变可影响铁代谢的稳态并影响红细胞的生成。

4.展望

机体通过复杂而又精确的机制维持铁稳态，以满足红细胞生成以及其他细胞功能对铁的需求。高原低氧环境在多个层面和分子水平影响机体铁代谢相关蛋白表达及铁的吸收、存储与循环再利用的过程。高原低氧暴露可引起红细胞数的显著增加，导致高原红细胞增多症。铁代谢紊乱是否是低氧条件下直接引起红细胞增多症发生发展的原因？我们近期关于高原低氧暴露对脾脏功能的研究也揭示低氧暴露可显著抑制脾脏红髓巨噬细胞的数量和吞噬能力，是否是高原低氧暴露后巨噬细胞的铁过载影响了其数量及吞噬能力还需要通过进一步的研究去证实。