2-溴棕榈酸缓解脊髓炎性痛的机制研究*

董志斌，王煜嘉，李 岱，朱海丽

(湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100)

脊髓炎性痛是脊髓受损后常见的症状之一，导致脊髓炎的因素很多，包括脊髓损伤、感染及自身免疫性疾病等[1]。在中枢神经系统中，神经元和星形胶质细胞两者是结构和功能伙伴关系，在应对伤害或疾病时共同起作用。生理状态下星形胶质细胞处于静息态；病理性疼痛(包括神经痛、炎性痛和骨癌痛)状态下，脊髓星形胶质细胞被激活，释放促炎因子并维持疼痛[2]。

NLRP3炎症小体在炎症因子的加工和释放中起着关键作用，如白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-18[3]。NLRP3炎症小体由NOD样受体3(NOD-like receptor 3，NLRP3)、接头蛋白凋亡相关点状样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和效应蛋白半肤氨酸蛋白酶1前体(pro-caspase-1)组成。NLRP3炎症小体介导pro-caspase-1活化为caspase-1，进而导致IL-1β和IL-18的成熟和释放，发挥免疫炎症效应[4]。

2-溴棕桐酸(2-Bromopalmitate，2-BP)可影响蛋白质在膜结构上的定位及功能，是一种常用的蛋白棕桐酰化抑制剂[5]。本研究明确了鞘内给药2-BP对脊髓炎性痛的缓解作用，并探讨其病理机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验中使用的Sprague-Dawley(SD)大鼠购于湖北省实验动物中心，共18只，体质量180～200g，6～8周龄。动物合格证号：No.42000600041944。

1.2 主要试剂

二甲基亚砜(DMSO)、2-BP、蛋白酶抑制剂均购自美国Sigma公司，加强型RIPA lysis buffer、SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、TNF-α均购自上海碧云天生物技术有限公司。Anti-NLRP3(A12694)、anti-β-actin(A1978)、anti-ASC(A11433)、anti-caspase-1(A0964)、anti-GFAP(A19058)、HRP标记山羊抗兔IgG均购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。

1.3 模型建立及分组处理

构建大鼠脊髓炎性痛模型，方法如下[6]：剔除大鼠背部注射部位毛发并进行皮肤表面消毒，用无菌微量注射器于L5和L6脊椎棘突间隙垂直进针，进入蛛网膜下腔，缓慢倾斜45°注入100ng/10μL TNF-α，构建脊髓炎模型大鼠(建模组)，分为模型组(n=6)及模型给药组(n=6)；对照组大鼠注射同等体积生理盐水，分为空白对照组(n=3)和对照给药组(n=3)。随后所有大鼠，注入TNF-α或生理盐水半小时后，模型组和空白对照组鞘内注射10μL体积DMSO+生理盐水(体积比1∶1)，模型给药组和对照给药组注射200μg/10μL体积的2-BP溶液。2-BP溶解在DMSO中,使用前用生理盐水按体积比1∶1进行稀释。

1.4 大鼠自发性缩足反射次数记录

大鼠置于长宽高均为30cm的透明有机玻璃盒内，玻璃平板位于实验平台高50cm的支架上。实验开始前，将大鼠放置玻璃盒中适应30min，观察并记录每5min内大鼠自发性缩足(或舔爪)反射次数，记录3次。建模成功的基础上建模组和对照组分别放回盒内30min后记录缩足(或舔爪)次数/5min，记录3次。进而，继续鞘内注射DMSO+生理盐水(模型组和空白对照组)或2-BP(模型给药组和对照给药组)，30min后记录缩足(或舔爪)次数/5min，记录3次。

1.5 免疫印迹法检测脊髓组织GFAP、NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达水平

空白对照组、模型组和模型给药组大鼠行为学记录结束后，给予过量麻醉(10%水合氯醛5mL/kg)处死，分离脊柱，暴露脊髓，剥离脊膜，分离并得到腰段脊髓，进行免疫印迹实验检测胶质细胞标记物GFAP，炎症小体标记蛋白NLRP3、ASC、caspase-1的表达水平。具体过程如下：脊髓组织加入含有酶抑制剂的RIPA裂解液匀浆，12 000r/min、4℃离心15min取上清，BCA蛋白分析试剂盒检测上清中的蛋白质浓度。SDS-PAGE分离蛋白质样品，转PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭lh，一抗孵育过夜，二抗孵育1h，LAS500凝胶成像系统扫描观察，Image J软件对比分析空白对照组、模型组和模型给药组的条带灰度值。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 成功构建大鼠脊髓炎性痛模型

以大鼠自发性缩足(或舔爪)反射次数(Flinches)评估大鼠自发性痛情况。如图1所示，与对照组相比，注射TNF-α后建模组缩足次数明显上升(P<0.05)，表明脊髓鞘内注射TNF-α引发大鼠外周痛觉过敏建模成功。

与对照组比较，*P<0.05

2.2 2-BP鞘内给药缓解大鼠脊髓炎性痛

为了检测2-BP对脊髓炎性痛的作用，鞘内给药2-BP后记录大鼠自发性缩足(或舔爪)反射次数。如图2显示，模型给药组大鼠的自发缩足次数明显降低(P<0.05)。同时，对照组中2-BP对正常大鼠的行为学没有影响(P>0.05)。该结果表明鞘内给药2-BP可有效缓解脊髓炎引发的痛觉过敏。

与模型组比较，*P<0.05

2.3 2-BP降低GFAP蛋白表达水平

如图3所示，与空白对照组相比，模型组大鼠脊髓组织中GFAP的表达明显上调(P<0.05)。2-BP给药处理后，脊髓中GFAP的表达明显下调(P<0.05)。表明2-BP鞘内给药显著降低GFAP的蛋白表达水平，降低星形胶质细胞过度激活。

与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.4 2-BP抑制NLRP3炎症小体活化

为验证2-BP对炎症反应的影响，我们检测了NLRP3炎症小体变化水平，包括核心蛋白NLRP3、衔接蛋白ASC和效应蛋白caspase-1的表达，其中pro-caspase-1表征caspase-1的本底表达水平，cleaved-caspase-1表征caspase-1的活化水平。免疫印迹结果显示，与空白对照组相比，模型组大鼠脊髓组织中NLRP3、ASC以及cleavad-caspase-1蛋白表达均增加(P<0.05)。但2-BP给药后NLRP3、ASC以及cleavad-caspase-1的表达水平均明显下调(P<0.05)。上述数据表明，鞘内给药2-BP显著抑制NLRP3炎症小体活化，从而降低脊髓炎症。

与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3 讨 论

本研究以大鼠脊髓炎模型为研究载体，探究2-BP对脊髓炎引发外周痛觉过敏的作用以及相关机制。脊髓组织是小胶质细胞、星形胶质细胞主要分布区域，当诱导脊髓炎症时，这些细胞均会发生炎症激活及代谢异常导致疼痛[7]。GFAP是scar-星形胶质细胞的标志物，反映星形胶质细胞的活性[8]。脊髓炎症包含有多种炎性蛋白参与其形成，由于细胞代谢异常启动炎症NLRP3小体形成，继而促进接头蛋白指向ASC及caspase-1蛋白的表达，从而促进脊髓神经细胞的损伤引起脊髓炎症性疼痛。在炎性因子诱导的脊髓炎模型中，2-BP给药后，脊髓组织中GFAP表达明显降低，表明2-BP可有效降低星形胶质细胞激活。

星形胶质细胞激活可引发炎性蛋白及炎症的形成，NLRP3炎症小体是影响炎症因子表达活化的重要调节因素[9]。静息状态下 NLRP3 位于内质网膜，病理状态被激活后，NLRP3和其配体ASC聚集到细胞核周围，诱导pro-caspase-1转变为成熟的cleavage-caspase-1，进一步切割pro-IL-1β和pro-IL-18，将其转变为具有生物活性的IL-1β和IL-18，并释放到细胞外组织中，参与后续的炎症瀑布反应，强烈的炎症反应会导致脊髓中的神经元死亡[10]。为表征2-BP对炎症小体的作用，如图4所示，我们发现2-BP显著降低NLRP3、ASC和cleavage-caspase-1的蛋白表达，表明2-BP可抑制NLRP3炎症小体活化，

降低星形胶质，最终发挥缓解脊髓炎性痛的作用。

综上所述，2-BP可能通过调节炎性小体NLRP3在小胶质细胞与星形胶质细胞中合成，进而改善药物诱导动物的炎性疼痛，同时该研究也为2-BP在抗炎镇痛中的作用提供了一定的理论依据。