p53对平滑肌细胞向成骨样细胞转分化的影响*

刘 菲，李清洁，李世环，李敏才

(1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院基础医学院)

血管钙化(vascular calcification，VC)是钙盐、磷酸盐等矿物质沉积于血管壁的过程[1]，已经成为动脉粥样硬化、糖尿病、高血压及慢性肾病等疾病发生率和死亡率增加的独立危险因素[2]。近年来的研究证实VC是主动的可调控的钙盐及磷酸盐高度有序矿化，类似于骨发育生物学过程[3]。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMCs)表型转化是VC的重要现象，VSMCs蛋白合成增加，产生大量细胞外基质，分泌骨相关蛋白，促进VSMCs转分化为骨样细胞，从而导致血管钙化。前期实验[4-6]已经诱导VSMC表达成骨样细胞表型，并阐明了micro-206可以抑制VSMC表型转化。

p53是细胞生长周期中的负调节因子，对细胞生长周期调控发挥重要作用。人体AS斑块中p53表达上调，与血管壁细胞凋亡调节有关。Zheng等[7]报道p53介导肿瘤中上皮-间质转化现象，Li等[8]报道p53介导心肌梗死中内皮细胞转化为成纤维细胞，参与纤维修复，Ubil等[9]报道心肌梗死后，增强的p53表达促进心肌成纤维细胞转分化成上皮细胞。我们推测p53与VC中VSMC表型转化调控密切相关，为此，我们建立小鼠动脉硬化模型，给予p53抑制剂/激动剂药物，观察其对血管钙化的影响，期望对VC调控提供新的靶点和数据资料。

1 材料与方法

1.1 动物

21只apoE-/-雄性小鼠，6～8周龄，体质量约23g，购买于北京Charles river实验动物技术有限公司。动物合格证号：SYXK(鄂)2019-0031。动物饲养于SPF级动物房，温度控制在21℃～27℃，湿度控制在50%～60%，维持昼夜节律。

1.2 试剂和仪器

油红O染液(索莱宝公司)，苏木素染液(索莱宝公司)，伊红染液(索莱宝公司)，茜素红染液(塞维尔公司)，体视显微镜(Mshot公司)。

1.3 方法

1.3.1 VC模型构建

21只雄性6～8周龄apoE-/-小鼠，高脂饮食饲养12周后，将小鼠随机分为3组，每组7只，对照组(Con组)、p53激动剂Parthenolide(Par组)、p53抑制剂Pifithrin/-u(PFT-u组)。Par组每只小鼠经腹腔注射5mg/(kg·d)剂量[10]的Parthenolide，PFT-u组每只小鼠经腹腔注射3mg/(kg·d)剂量[11]的Pifithrin/-u，继续饲养4周，对小鼠胸主动脉、颈总动脉予以取材。

1.3.2 油红O染色

取油红O粉末0.5g，溶于100mL异丙醇，混匀，用滤纸过滤得油红O储备液，4℃避光保存。以储备液∶超纯水=3∶2比例配置油红O溶液，混匀后，经0.22μm过滤头过滤，静置10min。血管用60%异丙醇浸泡30min，放入油红O溶液中漂染3h，60%异丙醇溶液洗至胸主动脉背景干净。体视显微镜下观察拍照。

1.3.3 茜素红染色

石蜡切片经常规脱蜡至水化，将切片放入盛有茜素红染液的染缸里5～10min进行染色，然后用自来水冲洗，将切片放到烘箱内将水分烤干，盖玻片封片最后用显微镜进行图像采集。

1.3.4 HE染色

石蜡切片经常规脱蜡至水化，将切片放入苏木素染液中，染3～5min后用自来水冲洗约2min，1%盐酸乙醇酸化15s，水洗约2min，0.6%氨水返蓝1min，继而水洗约4min，切片入伊红染液中染色30s，水洗2min，脱水封片，显微镜镜检，采集图像。

1.3.5 血管环功能测定

取材后，在体式显微镜下迅速将胸主动脉周围的多余脂肪剥离，然后剪取一段长约3mm的血管环，继用两根25μm的钨丝穿过血管环，将钨丝分别固定于张力浴槽的两端，且两根钨丝处于平行状态，用Krebs-Henseniet洗两次，每次15min，然后用氯化钾溶液预收缩5min，加入U46619收缩剂，稳定后依次加入不同浓度的乙酰胆碱(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5)，各个浓度作用时间约为5min，平衡5～10min后，更换Krebs-Henseniet液2次，平衡后加入U46619收缩剂，约45min稳定后依次加入不同浓度的硝普钠(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5)，作用时间约为5min。记录数据。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 p53抑制剂减少主动脉血管粥样硬化斑块

如图1A显示，小鼠胸主动脉与腹主动脉部分组织染成红色，表明均有斑块形成。定量分析血管斑块面积与血管总面积，如图1B显示，与Con组相比，PFT-u组斑块面积/整体面积比值明显降低(P<0.05)，Par组斑块面积/整体面积比值显著升高(P<0.05)；与Par组相比较，PFT-u组斑块面积/整体面积比值显著性下调(P<0.01)。表明p53抑制剂抑制动脉粥样硬化形成，p53激动剂加重动脉粥样硬化斑块进展。

A.主动脉大体油红O染色；B.定量分析斑块面积/整体面积比值(*P<0.05，**P<0.01，n=3)

2.2 p53抑制剂抑制动脉粥样硬化斑块形成

如图2A(封三)结果显示，小鼠颈总动脉管壁增厚、斑块形成，管腔均有一定程度的狭窄。为检查斑块对血管狭窄程度的影响，以斑块面积/血管腔面积比值进行定量分析。与Con组相比，PFT-u组斑块面积/血管腔面积比值降低，具有显著性差异(P<0.05)；Par组斑块面积/血管腔面积比值上调，没有显著性差异(P>0.05)。与Par组相比，PFT-u组斑块面积/血管腔面积比值下调，具有极其显著性差异(P<0.01)。结果表明p53抑制剂抑制动脉粥样硬化斑块形成，缓解斑块造成的动脉血管狭窄。

2.3 p53抑制剂减弱动脉粥样硬化斑块内膜的增生

如图3A(封三)染色结果显示，Con组动脉血管壁斑块处结构紊乱，斑块处内膜增厚，内弹力膜结构比较模糊；Par组动脉血管壁斑块处内膜增厚严重，内外弹力膜消失；PFT-u组动脉血管斑块处内膜增厚减弱，内外弹力膜较为清晰、完整。为确定p53抑制剂对内膜增厚的影响程度，以内膜面积/血管总面积比值进行定量分析，如图3B所示：与Con组相比，PFT-u组血管内膜面积/血管总面积比值降低，具有显著性差异(P<0.05)；Par组血管内膜面积/血管总面积比值升高，具有显著性差异(P<0.05)；与Par组相比，PFT-u组血管内膜面积/血管总面积比值降低，具有极其显著性差异(P<0.01)。结果表明，p53抑制剂减弱动脉粥样硬化斑块内膜增生，缓解血管腔狭窄。

2.4 p53抑制剂改善主动脉血管功能

取apoE-/-小鼠主动脉血管环，先加入U46619引起血管进行收缩，待测定系统平衡后，加入不同浓度的乙酰胆碱和硝普钠舒张血管，检测并记录血管舒张程度。结果如图4A显示，在乙酰胆碱作用下，与Con组相比，PFT-u组小鼠胸主动脉舒张功能升高，具有显著性差异(P<0.05)；Par组小鼠胸主动脉舒张功能降低，无显著性差异。与Par组相比，PFT-u组小鼠胸主动脉舒张性显著升高(P<0.05)。在硝普钠的作用下，结果如图4B显示：与Con组相比，PFT-u组小鼠胸主动脉舒张功能升高，无显著性差异；Par组小鼠胸主动脉舒张功能降低，无显著性差异；与Par组相比，PFT-u组小鼠胸主动脉舒张性显著升高(P<0.05)。结果表明p53抑制剂能上调动脉粥样硬化血管的舒张功能。

A.主动脉在乙酰胆碱作用下的舒张作用；B.主动脉在硝普钠作用下的舒张作用(*P<0.05，n=3)

3 结 论

心血管疾病(cardiovascular diseases，CVD)是世界上造成死亡和致残的主要原因，它代表着全球性的健康问题，CVD的特征是一系列疾病，与多种危险因素之间的复杂相互作用有关[12]。动脉粥样硬化是引起心血管疾病死亡的主要原因，是以脂质沉积和斑块形成为主要特征的慢性进行性血管炎症[13]。血管钙化是指血管细胞异位矿化[14]，是一个活跃而复杂的过程，涉及钙在动脉壁中沉积的多种机制。研究VC发病机理及调控机制具有非常重要的临床意义，我们建立动脉粥样硬化模型，模拟VC病变过程，并研究其病变的形态学特征。

p53是经典的肿瘤抑制基因，是细胞生长周期中的负调节因子，对诱导细胞生长周期抑制和凋亡发挥重要作用；同时p53是重要的应激-反应基因，参与细胞重新编排[15]。我们在本研究中发现p53抑制剂减少动脉粥样硬化斑块面积、减少血管管腔狭窄、抑制动脉内膜增生，改善胸主动脉血管功能。

Tataria等[16]发现p53基因可以结合到软骨瘤osterix启动子区域，对软骨细胞分化标志物之表达有重要调节作用，促进osterix、Cbf1a/Runx2、ALP等成骨细胞因子表达。已有研究表明[17]，VSMC在氧化应激、炎症和机械损伤等刺激下，向具有分泌功能细胞转化，分泌骨形成相关蛋白，如骨形态发生蛋白(bone morphogenic protein-2，BMP2)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)等蛋白，促进钙化形成。我们的研究结果符合这些研究现象，p53可以参与血管平滑肌细胞向成骨样细胞转分化，抑制血管平滑肌细胞向成骨样细胞转分化，从而抑制动脉粥样硬化的斑块形成，这为动脉血管硬化的治疗又提供了一条新思路。