CS/CMC/HAP/TCP复合PGMA材料的合成研究*

张 鹏，黄俊潮，屈 亮，张光学

(湖北科技学院核技术与化学生物学院，湖北 咸宁 437100)

随着全球人口数量增加及人均寿命的提升，每年因骨折、患病造成骨坏损需要进行骨矫正与骨移植手术的病例呈上升之势，需要大量的骨修复材料，常用的材料有自体骨、异体骨、异种骨及人工骨材料4种[1]。从生物学角度考虑，自体骨是理想的骨移植材料，但从骨来源、手术给患者造成痛苦的角度考虑也存在不足；虽然异体骨与异种骨可以解决骨来源问题，却因其存在免疫排异反应或传染疾病的风险也受到了限制。因此，骨移植材料来源就落在人工骨材料方面。

羟基磷灰石(HAP)与磷酸三钙(β-TCP)都是骨组织的主要成分和骨组织修复的良好材料，已在临床医学上得到了广泛的应用[2]。壳聚糖(CS)具有良好的生物相容性、生物可降解性且降解产物可被人体完全吸收，明显改善材料的力学性能，促进骨细胞的黏附、增值作用[3]。羧甲基纤维素钠(CMC)具有可降解、生物相容性及较强的粘结性[4]。聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)具有较好力学性能，但由于表面光滑，骨细胞附着性、骨传导性及骨再生修复功能存在缺陷，所以寻找具有良好的力学性能、再生修复作用强的人工骨材料一直是科研工作者追求的目标。我们采用CMC、CS、HAP、β-TCP与甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)经辐照聚合制备人工材料，现将过程总结报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

骨水泥材料采用钴源辐照方法，于湖北省农业科学院完成。

主要试剂与仪器：壳聚糖，脱乙酰度90%，BR，国药集团化学设计有限公司；纳米HAP：AR，β-TCP：AR，GMA：98%，AR，以上皆购于上海阿拉丁有限公司；人骨肉瘤细胞(U2OS)，ATCC；1640培养液、缓冲液FBS、青霉素、链霉素，皆为Gibco，USA。

X射线衍射仪(X’Pert Pro MPD，Philips，Ducth)；Inspect-F扫描电子显微镜(FEI，USA)；万能材料试验机(AG10TA，JEOL，Japan)；倒置相差显微镜(Olympus，USA)。

1.2 实验方法

1.2.1 复合骨水泥材料的制备

分别配制20% CS与20% CMC凝胶，取混合凝胶(各50%)1g数份，依次加入0.0、0.1、0.2、0.3、0.4g质量(HAP/TCP=1)粉体，与混合凝胶充分搅拌混匀后，置于模具中定型。定型的固体先在50℃真空中48h干燥至恒重，然后让固体材料整体浸泡液体GMA中；数天直至恒重取出，将其置于钴源中辐照，辐照总剂量为14kGy，制成复合材料，见图1(封三)。

1.2.2 扫描电镜观察

将复合材料烘干后真空喷金，用扫描电镜扫描试样表面，观察样品表面形貌，记录并照相。

1.2.3 X射线衍射分析

采用X射线衍射仪对HAP、β-TCP、PGMA复合材料分别进行了物相组成分析，分析条件为：电压35kV，电流25mA，衍射起始角10°，衍射终止角80°，步宽0.06°，波长1.5406 nm。

1.2.4 复合材料的力学性能测试

使用万用材料试验机对不同质量比复合材料进行抗压强度测试，于室温以1mm/min的速度等速加载压缩，直至样品破裂或者厚度减少60%。按照公式计算强度[5]，抗压强度(MPa)=4Fmax÷πd2，其中Fmax为最大加载力(kg)，d为试件的直径(mm)。每种样品测3次，取平均值。

1.2.5 复合材料细胞增殖实验

将材料切成2mm厚，直径10mm的小块，置于EP管中121℃高压灭菌20min；将灭完菌的材料置于12孔板上预湿，每空一块材料，每种材料置3孔，并设3孔为不加材料的空白对照组；将第三代U2OS细胞以1×105/孔定量接种在材料上，每孔2mL培养液，于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养，每天换一次液；培养一周后，用胰蛋白酶EDTA消化吸收细胞，将细胞计数后求平均值；增值率=(平均细胞数-初始细胞数)/初始细胞数。

2 结 果

2.1 X射线衍射分析结果

从图2可知，复合材料中HAP(2θ=32.1°的主峰和33°的次强峰)与β-TCP(2θ=31°的主峰和33.2°的次强峰)的特征衍射峰清晰可见，材料的复合并没有改变HAP与β-TCP的结构，其与混合凝胶、PGMA之间的复合应为物理结合。

图2 复合材料的X射线衍射图谱

2.2 抗压强度检测结果

表1是1.0g混合凝胶中加不同质量的粉体(HAP/β-TCP=1∶1)，不加GMA未辐照时所测定的复合材料的压缩强度；1.0g混合凝胶中加不同质量的粉体(HAP/β-TCP=1∶1)，浸泡GMA辐照聚合后所测定的复合材料的压缩强度，所得结果明显高于不加GMA未辐照的复合材料。

表1 添加不同质量粉体复合材料的力学性能表

2.3 扫描电镜观察结果

1g质量混合凝胶中加0.3g粉体(HAP/β-TCP=1∶1)扫描电镜观察。图3a为放大10k倍，未加GMA不辐照，材料中空隙较大，其原因是材料干燥过程中凝胶中的溶剂挥发所致。图3b放大10k倍，加GMA辐照的材料中可以看见缝隙明显降低，其原因是材料浸泡了一定量的GMA，经钴源辐照生成了聚合物PGMA，降低了材料中的空隙。

图3 复合材料的扫描电镜观察图(10k倍)

2.4 U2OS细胞形态学观察结果

表2是人肉瘤骨细胞培养7d的细胞增殖情况。从表中可知，复合材料有利于细胞增殖。图4(封三)为倒置显微镜观察U2OS细胞形态，A-C为壳聚糖与HAP和β-TCP比例为0.1、0.2、0.3复合材料浸提液中的细胞，D为阴性对照组，细胞在不同比例的复合材料浸提液中生长良好，与阴性对照组没有差别。

表2 细胞相对增值率对照表

3 讨 论

上述复合材料经真空干燥后，材料中的溶剂分子将会逸出一部分留下空隙，将其放于GMA中浸泡，GMA慢慢渗透到材料空隙中。将浸泡的材料于60Coγ射线辐照，GMA转化生成PGMA凝胶，进一步降低材料中的空隙，因而复合材料压缩强度得到了进一步的提高。

由于混合凝胶为CS与CMC，CS与CMC在组织体液中长时间浸泡，CS与CMC就会发生降解和溶解，导致材料的力学性能迅速下降；而骨组织再生修复过程是一个比较缓慢的过程，所需时间要达数月甚至更长。为充分保证复合材料高强度力学性能，避免给患者二次手术造成痛苦；将材料添加GMA进行辐照，增加疏水性的PGMA高分子聚合物。一方面可以进一步提高材料的压缩强度，另一方面可以延缓CS与CMC降解和溶解的速度，骨组织进行再生修复时，骨材料的力学性能不会迅速下降。

由于HAP具有良好的生物相容性，与骨组织成分相似，目前骨外科矫形材料应用较多，HAP的强度不高且难以降解，不利于骨组织的再生与修复。为寻找优异性能的骨移植材料，很多学者[2-6]采用CS、CMC复合的方法。TCP强度不高，在体内代谢生成Ca2+、 PO43-，被骨组织吸收，促进骨组织的再生与修复。CS是天然高分子聚合物，具有消炎、杀菌、生物体内易降解及良好的生物相容性而广泛用于生物复合材料。图4的生物学实验进一步说明，复合材料有利于细胞的附着与增殖；利用CS、CMC易于降解之特性，其降解所留下来的孔隙，将有利于骨细胞体液的传导，更好地促进骨组织再生与修复。

为解决骨外科矫形材料力学性能不足，目前较多的是用高分子聚合物聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)进行复合[7]，而PGMA的结构与PMMA非常相似，用作生物材料也未见文献报道；采用辐照法合成PGMA高分子聚合物，操作简便易行，可以根据所需矫正骨的形状设计相应的模具，再将复合材料加到模具中即可制成不同形状骨组织材料。本次抗压强度实验结果说明，随着粉体量的增加，复合材料的力学性能呈先增后降趋势，实验中加入0.2、0.3g粉体所制备的复合材料皆在180MPa以上，完全可以满足骨组织替代材料力学性能的要求。U2OS为人骨肉瘤组织中分离的细胞，对化合物及病毒极其敏感，已广泛用于体外生物医学实验[8]；表2与图4的细胞形态学实验表明，所制备的复合材料具有良好的生物相容性。

总之，采用辐照方法合成PGMA高分子聚合物，能将CS、CMC、HAP/β-TCP粉体很好的融合为一体，方法简便、生物相容性好，既满足了骨材料力学性能的要求，又兼顾了骨组织再生修复，有望成为骨外科矫形材料一种新的合成方法。