小鼠大脑皮质星形胶质细胞的培养、鉴定及其TRPC1-7 mRNA的表达

刘阳生

(咸宁市第一人民医院神经内科，湖北 咸宁 437000)

中枢神经系统中，星形胶质细胞约占大脑总体积50%[1]，它为神经元提供能量与营养支持，调节突触活性，还可以调节神经元内外离子、水以及神经递质的平衡，影响神经元的电活动。星形胶质细胞的这些特点决定其在缺血性脑损伤、神经细胞再生和神经退行性疾病中均发挥着重要作用[2]。高纯度星形胶质细胞的获得是体外研究其功能和机制的基础。星形胶质细胞原代培养过程中，易混杂多种细胞成分如成纤维细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞，因此，建立一种稳定有效的星形胶质细胞培养纯化方法是体外研究的前提，为体外研究其功能和机制打下基础。

瞬时受体电位(transient receptor potential，TRP)是重要的Ca2+通道，广泛分布于从酵母到人类的各种生物体，通过改变细胞内游离钙的浓度而发挥重要作用，有研究表明其与神经系统疾病相关[3]。哺乳动物TRP超家族可分为TRPA、TRPC、TRPM、TRPML、TRPP、TRPV和TRPN 7个家族，在体内分布广泛，TRPC离子通道是位于细胞膜上的一类非选择性阳离子通道，迄今，已在哺乳动物中发现7种TRPC蛋白：TRPC1、C2、C3、C4、C5、C6和C7，其中TRPC2为一种假基因编码故在人体内缺失[4]。钙库操纵性钙内流(SOCE)，即细胞内质网钙库耗竭，从而引发胞外Ca2+流入细胞内质网的这一过程，SOCE钙通道的开放或关闭，调节细胞外Ca2+内流。一般认为，SOCE通道有赖于TRPC和Orai(calcium-release-activated-calcium channel protein)的参与[5]。众所周之，星形胶质细胞为非兴奋性细胞，且SOCE在非兴奋性细胞的钙信号中很重要[6]，TRPC通道在培养星形胶质细胞中都有表达[7]，因此，TRPC通道在星形胶质细胞中作为常见信号传递方式之一，胞内Ca2+水平变化与细胞生长、运动、周期、分泌、兴奋、代谢、转录、细胞分化及凋亡等相关。TRPC通道的过表达、缺失和活化都对胞质Ca2+水平产生影响，导致钙稳态失调，继而对细胞功能产生影响。近年来，一些疾病被发现与TRPC通道的异常有关，因此，TRPC通道有望成为药物治疗的靶点[8]。本研究观察体外培养星形胶质细胞TRPC1-7 mRNA的表达，为体外研究星形胶质细胞TRPC通道与神经系统疾病的关系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

1～3d的乳鼠40只，体质量2～3g，C57BL/6购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。实验过程按实验动物使用3R原则给予人道关怀，并通过伦理审查。

1.1.2 主要设备及试剂

CO2细胞培养箱、倒置显微镜FV500、FLUOVIEW共聚焦显微镜、实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)仪、空气恒温摇床、DMEM/F12培养基、D-hanks、PBS、TRIzol试剂、逆转录试剂盒、胰蛋白酶、多聚赖氨酸、兔抗GFAP多克隆抗体、羊抗兔IgG。

1.2 方法

1.2.1 大脑皮质星形胶质细胞原代培养

选取出生3d以内的乳鼠备用。取脑前为减少脑部血供用冰包埋4min，再用75%酒精消毒，用眼科剪剪开皮肤，剔除覆盖于大脑上半部分的颅骨并取脑置于4℃ D-Hanks中。大脑经冰的D-Hanks漂洗后，放置于消毒过的滤纸上吸除多余液体，用眼科弯镊摘除大脑半球，仔细剥离海马、脑膜和血管等纤维成分。移入EP管内，用眼科剪充分剪碎，加入1mL 0.25%胰酶，置于培养箱37℃消化15min，每5min震荡一次，用混有10%FBS的DMEM-F12终止消化，用吸管反复轻轻吹打，混匀至无明显组织块，吸取液体过200目筛网后1 000rpm离心5min，弃上清液，加入混有15%FBS的DMEM-F12重悬，接种于预先用多聚赖氨酸包被的培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱孵育差速贴壁培养，于30min、1h分别取出并轻轻翻转培养瓶，吸出上清液以除去贴壁的成纤维细胞，将细胞悬液移至新的培养瓶中，24h后全量换液，以后3d换液一次。9d后待细胞生长分层，将培养瓶放入37℃摇床260rpm摇晃18h，弃除小胶质细胞和少突胶质细胞，温D-Hanks漂洗细胞，用0.25%胰酶消化、传代，减半接种，待37℃培养箱培养3～5d铺满瓶底，消化、传代，一半细胞接种继续培养，其余细胞接种于盖玻片，免疫荧光法鉴定星形胶质细胞。

1.2.2 大脑皮质星形胶质细胞的免疫荧光鉴定

GFAP是星形胶质细胞所特有的骨架蛋白，可作为成熟星形胶质细胞的标志物[9]。采用免疫荧光染色对星形胶质细胞进行鉴定。步骤如下：星形胶质细胞接种于盖玻片上，24h后经PBS漂洗，置于4%多聚甲醛中浸泡固定30min；细胞标本用PBS漂洗3次，10min/次；0.1%Triton滴于细胞上破膜5min；PBS漂洗3次，10min/次；将10%的羊血清滴于细胞标本上封闭30min；3%BSA稀释一抗，配制成兔抗GFAP(1∶500)工作浓度，一抗滴覆于细胞标本上，4℃孵育过夜；PBS漂洗盖玻片3次，10min/次；羊抗兔CY3(1∶2000)二抗避光孵育2h；二抗孵育后PBS漂洗3次，10min/次；将盖玻片倒扣于处理过的载玻片上，甘油封片，于激光共聚焦显微镜下20倍观察拍照。

1.2.3 逆转录RT-PCR

根据GenBank小鼠TRPC1-7序列进行引物设计：TRPC1上游5′-CTCAAAGTGGTGGCTCACAACAAG-3′下游5′-CATAGAGCTGAGTCAGTCCAATCG-3′；TRPC2上游5′-GGCTGTCAACTACAACCAGAAACAG-3′下游5′-AGCTGGCAGAATATATGCCAGTCG-3′；TRPC3上游5′-GGACTGTCTGAAGTGACTTCTGTT-3′，下游5′-CTCGAGTGAGACTGTGTGAAGAGG-3′；TRPC4上游5′-GTGGAGTGGATGATATTACCGTGG-3′，下游5′-TCAGGATGTCCAGAAGCATCCTTC-3′；TRPC5上游5′-TCCATGATTGGTGGAACCTGATGG-3′，下游5′-AGCATATTCAGCAGCACTACCAGG-3′；TRPC6上游5′-CCTACTGATCCTCAGATCATCTCT-3′，下游5′-CTCTGCATCTTCTTGGAAGCCTTG-3′；TRPC7上游5′-GACGGAGATGCTCATCATGAAGTG-3′，下游5′-CGGTAGTAGGAGTACAGGTTGAAC-3′PCR反应体系如下:cDNA 1μL，上游引物和下游引物各1μL，2×Mix 6.3μL，超纯水4.2μL，总体系12.5μL。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，退火30s，退火温度：TRPC1 64.6℃，TRPC2 64.2℃，TRPC3 64.2℃，TRPC4 65.7℃，TRPC5 65.9℃，TRPC6 64.2℃，TRPC7 65.2℃，72℃延伸1min，40个循环后，72℃延伸5min。最后进行琼脂糖凝胶电泳。

2 结 果

2.1 星形胶质细胞的免疫荧光鉴定

体外培养的星形胶质细胞中，GFAP阳性的细胞可达总细胞数的95%，星形胶质细胞标志物GFAP细胞胞质为绿光标记，DAPI细胞胞核为蓝光标记，见图1(封三)。

2.2 星形胶质细胞TRPC1-7 mRNA的表达

RT-PCR产物证实小鼠星形胶质细胞上有TRPC1-7 mRNA的表达，见图2。

图2 星形胶质细胞TRPC1-7 mRNA的表达

3 讨 论

星形胶质细胞的纯化是进行其功能研究的基础。本实验选取出生3d以内的乳鼠，其脑组织分离细胞悬液中星形胶质细胞含量较多，且新生鼠脑膜较易剥离[10]，脑膜和血管等纤维成分对细胞的污染会降低，有利于星形胶质细胞的生长。

原代培养的星形胶质细胞贴壁相对较缓慢，因此，培养瓶预先用低浓度的多聚赖氨酸预包被，发现3～5h后绝大多数细胞贴壁良好。在细胞培养中，加入15%胎牛血清和DF12培养液重悬，未使用任何其它添加物，星形胶质细胞长势良好。

组织消化时要选择合适的消化时间，避免消化过度从而对细胞造成较大的损伤。传代时胰酶的使用浓度0.25%较适宜，且消化时要密切观察细胞的状态，及时终止消化，传代时减半接种。

原代分离的细胞悬液中，有神经胶质细胞、神经元、成纤维细胞等。本实验通过选择日龄合适的乳鼠，多次消化传代、减半接种以及纯化时借助37℃摇床机械振荡，获得了较纯的星形胶质细胞。本实验选取适龄乳鼠、分离组织时仔细剥离脑膜和血管等纤维成分、使用差速贴壁技术，来减少成纤维细胞的污染。至于培养物中的神经元，没有特定的培养液在体外难以存活。少突胶质细胞在原代培养时位于星形胶质细胞层上，可借助恒温摇床机械振荡、多次传代去除。

TRPC每四个家族蛋白可形成同源或异源四聚体，四聚体组成非选择性阳离子通道，钙离子经此通道进入细胞内，在神经系统，TRPCs参与神经干细胞增殖分化、神经元保护、轴突生长及导向、突触形成等一系列神经生理功能，是当前研究的热点之一。如何通过干预脑内TRPC治疗神经系统疾病，从而发掘新型治疗神经系统疾病的药物成为研究的热点[11]。有研究[7]报道TRPC通道(TRPC1-6)在培养星形胶质细胞中都有表达，本实验也观察到培养的大鼠星形胶质细胞上存在TRPC通道，有TRPC1-7 mRNA的表达。

在神经系统，TRPCs与多种神经系统疾病的发病相关[12]，因此，利用星形胶质细胞体外培养进行TRPC表达研究越来越受到重视。培养较纯的、稳定的星形胶质细胞是在体外研究TRPC通道的前提条件，对阐明和研究其在神经系统疾病中的作用以及为发掘新型治疗神经系统疾病的药物或干预措施奠定理论基础。