赤芍治疗肝纤维化网络药理学机制探讨

安祯祥,张安邦,何远利,黄 丹,王 敏,唐东昕,王 芳

(贵州中医药大学第一附属医院,贵州 贵阳550001)

肝纤维化(Hepatic fibrosis,HF)是指肝脏中细胞外基质的弥漫性过度沉积与异常分布,是肝脏的病理性修复反应,是慢性肝病向肝硬化/肝癌发展的关键步骤和重要环节。肝纤维化在组织学上是可逆的,而肝硬化难以逆转[1]。有效地预防、逆转肝纤维化可以延缓或防止肝硬化发生。目前尚无治疗纤维化的化学或生物药物,而中医药在该领域有明确的优势[2]。抗纤维化治疗是一个综合治疗,其中病因治疗和抗炎治疗是首要策略,但是针对细胞外基质沉积和降解,抑制肝星状细胞活化仍然是不能替代的治疗。赤芍是活血凉血、散瘀止痛的代表药物,广泛用于急慢性肝病治疗中。但是作为单一用药,需进一步深入研究。赤芍(Paeoniae RadixRubra)为毛茛科植物芍药(Paeonia lactifloraPall.)或川赤芍(Paeonia veitchiiLynch)的干燥根,味苦,微寒,入肝经,具有凉血散瘀、清热止痛的功效,可用于肝郁胁痛、癥瘕腹痛等肝胆疾病[3-5]。研究表明赤芍具有一定的保肝、抗肝纤维化作用[6-9]。然而其抗HF药效物质及作用机制需要进一步明确。中药网络药理学是多学科的交叉产物,利用系统生物学、系统药理学、分子生物学、生物信息学、计算机技术等,突破了传统“单药物、单靶点、单途径”,切合中药的“整体性、多靶点、多通道”特点,通过构建药物与基因、靶点和疾病之间的相互作用网络,探寻中药的作用机制。本研究采用网络药理学方法对赤芍抗HF的活性成分、作用靶点和信号通路进行分析,探讨其治疗肝纤维化的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 赤芍活性成分与作用靶标的筛选

利用TCMSP数据库(https://tcmspw.com/tcmsp.php)筛选赤芍所有化学成分,以口服生物利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%和类药性指数(Drug like index,DL)≥0.18为筛选指标,活性成分输入TCMSP数据库检索其作用靶标,运用Uniprot数据库査询靶标蛋白对应的基因名称。

1.2 肝纤维化疾病靶标收集

以“hepatic fibrosis”为关键词,检索GeneCards(https://www.genecards.org)数据库、OMIM(https://www.omim.org)数据库中肝纤维化相关基因,并去除重复基因。

1.3 赤芍活性成分靶点与肝纤维化靶点蛋白相互作用

将赤芍有效活性成分作用靶点与肝纤维化靶点取交集,得到两者的韦恩图。

1.4 成分-疾病-靶点网络构建

在GeneCards(http://www.genecards.org/)、OMIM(http://www.omim.org/)数据库中检索肝纤维化疾病相关靶蛋白,物种设置为人类,利用Uniprot(http://www.uniprot.org/)数据库将其转化为基因名称,采用R语言提取成分作用靶点与肝纤维化疾病靶点的共有靶点,Cytoscape 3.7.1软件构建赤芍活性成分-疾病-靶点网络。

1.4 PPI网络构建与可视化

String(https://string-db.org)数据库收集了大量的蛋白质-蛋白质相互作用关系(Protein-protein interactions,PPI)。将赤芍活性成分靶标与肝纤维化疾病靶标的共有靶点导入String数据库,物种限定为“Homo sapiens(人)”,构建赤芍成分靶标-肝纤维化疾病靶标PPI。采用R语言筛选出PPI中的前30个核心蛋白。使用Cytoscape 3.7.1软件对PPI网络进行分析和可视化处理,得到赤芍治疗肝纤维化的蛋白相互作用的PPI柱状图和点状图。

1.5 基因功能及通路富集分析

Gene ontology(http://www.geneontology.org)广泛用于基因功能的注释。Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes(KEGG,https://www.kegg.jp)是一个整合化学、基因组和系统功能信息的数据库,用于从分子水平信息中了解生物系统的高级功能和用途。将赤芍治疗HF关键靶标用R语言及Bioconductor进行基因功能和通路富集分析,通过条形图及气泡图展示。

2 结果

2.1 赤芍活性成分与靶点筛选

在TCMSP数据库中检索得到赤芍化合物119个,其中OB≥30%,DL≥0.18的活性成分29个,获取赤芍化学成分及作用靶标信息,包括芍药苷、芍药苷元酮、谷甾醇、菠菜甾醇、豆甾醇、儿茶素、并没食子酸、(2R,3R)-4-甲氧基-二苯乙烯、β-谷甾醇、黄芩素、campest-5-en-3beta-ol、stigmast-7-en-3-ol等化合物。见表1。根据赤芍活性成分预测其作用靶标,12个活性成分共作用于74个靶标,去除重复靶标,获得41个靶标,可见一个成分作用多个靶点,亦可见多个活性成分作用同一靶标。运用Uniprot数据库査询靶标蛋白对应的基因简称。见表2。

表1 赤芍的活性成分

表2 赤芍的药物靶点

2.2 肝纤维化疾病靶标收集结果

GeneCards和OMIM数据库收集HF疾病靶标4 033个。肝纤维化主要通过CF跨膜电导调节器、转化生长因子Beta 1、肿瘤坏死因子、干扰素γ、端粒酶逆转录酶、IL6等靶点进行调节。图3为部分靶点。

续表2

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表3 肝纤维化部分靶点

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2.3 赤芍成分靶点-肝纤维化靶点交集

在TCMSP数据库中搜索得到赤芍治疗疾病的靶标41个,GeneCards数据库与OMIM数据库搜索HF疾病的靶点4 033个,使用R语言对赤芍作用靶点与肝纤维化的疾病靶点取交集,构建赤芍活性成分靶点-肝纤维化靶点韦恩图,获得赤芍与HF共同作用靶标33个。见图1。

2.4 赤芍抗肝纤维化主要活性成分-靶点网络构建

应用Cytoscape软件构建赤芍抗肝纤维化成分-靶点网络,见图2。其中一个疾病节点,1个药物节点,12个药物活性成分节点,33个肝纤维化相关基因节点,赤芍的12种活性成分协同作用于33个肝纤维化基因,三角形、椭圆形节点分别代表赤芍活性成分、疾病的靶蛋白,边代表药物、活性成分和疾病靶蛋白的相互作用,体现了赤芍抗肝纤维化多成分、多靶点协同作用的特点。结果表明,赤芍29种活性成分中,与HF作用靶点直接相连的有12种活性成分,为赤芍治疗HF的有效活性成分,分别为芍药苷、芍药苷元酮、谷甾醇、菠菜甾醇、豆甾醇、儿茶酚、并没食子酸、(2R,3R)-4-甲氧基-二苯乙烯、β-谷甾醇、黄芩素、campest-5-en-3beta-ol、stigmast-7-en-3-ol。可见多个成分同时作用于一个或几个相同的靶点,部分靶点有多个作用成分,因此这些的靶点和成分成为赤芍中主要的活性成分和靶点。

图2 赤芍-肝纤维化-成分-基因网络图

2.5 赤芍靶点蛋白相互作用网络分析

利用STRING软件,将韦恩图中33个靶点作出蛋白质-蛋白质相互作用网络图及柱状图,结果IL6、VEGFA、ESR1、FOS、CASP3、RELA、AR、CYCS、CASP8、PGR、CASP9、HIF1A、CCNB1等基因处于核心地位,分别有20、19、18、18、17、17、15、14、12、12、11、11、10节点。见图3、图4所示。

图3 赤芍与HF共有PPI网络图

图4 赤芍抗HF作用靶点PPI分析

2.6 赤芍治疗肝纤维化基因功能富集分析

为进一步了解赤芍治疗肝纤维化关键靶标在生物体中发挥的作用,运行R语言对33个关键靶标进行GO基因功能富集分析,共获得73个生物学功能,根据P-vaule大小进行排序,选取前20条目展示,见图5。柱状图中纵坐标表示P值,横坐标表示富集的数目。P值越小颜色越深。结果显示,赤芍治疗肝纤维化关键靶标主要富集在对DNA结合转录激活因子活性、RNA聚合酶II特异性、核受体的活动、类固醇激素受体活性、RNA聚合酶II转录因子结合、RNA聚合酶II近端启动子序列特异性DNA结合、泛素样蛋白连接酶结合、G蛋白偶联受体活性、近端启动子序列特异性DNA结合、神经递质受体的活动功能活动中。

图5 赤芍抗肝纤维化作用靶点的GO分析

2.7 赤芍治疗肝纤维化通路富集分析

运行R语言对33个关键靶标进行KEGG通路富集分析,符合筛选条件的信号通路有78条,显示P值最小的前20条通路绘制气泡图,见图6。气泡图中纵坐标表示通路的名称,横坐标表示通路所占比例。P值越小颜色越深。其中与肝纤维化相关程度密切的信号通路有细胞凋亡、Th17细胞分化、IL-17信号通路、HIF-1信号通路、p53信号通路。赤芍抗HF部分通路图(乙肝、IL-17信号通路、细胞凋亡)。见图7-图9。

图6 赤芍抗肝纤维化作用靶点的KEGG分析气泡图

图7 赤芍对乙型肝炎作用靶点的作用位置

图9 赤芍对细胞凋亡作用靶点的作用位置

3 讨论

肝纤维化属于中医“胁痛”“积聚”范畴,基本病机为正虚瘀积,肝络受损,与肝络病密切相关。肝络是指肝脏的小血管,能营养肝脏及调节肝脏功能。肝纤维化病理关键为假小叶,假小叶病理基础在肝血窦。肝络与肝血窦的结构与生理相似,具有密不可分的关系,因此从“络病”治疗肝纤维化是一个重要的方法[10]。赤芍具有活血化瘀功效,是络病治疗的较好选择。

图8 赤芍对IL-17信号通路作用靶点的作用位置

通过TCMSP数据库,按口服生物利用度(OB)≥30%且类药性(DL)≥0.18的条件筛选赤芍活性化学成分29个,包括芍药苷、芍药苷元酮、谷甾醇、菠菜甾醇、豆甾醇、儿茶素、并没食子酸、(2R,3R)-4-甲氧基-二苯乙烯、β-谷甾醇、黄 芩 素、campest-5-en-3beta-ol、stigmast-7-en-3-ol等 化合物,其中主要的化学成分是单萜苷类、酚类、多糖等化合物,单萜苷类含有芍药苷、芍药新苷、芍药内酯苷、芍药苷元酮、芍药甙元酮、苯甲酰芍药苷、苯甲酰羟基芍药苷[11]。研究表明,赤芍中芍药苷、儿茶素以及β-谷甾醇的量较高[12],这些化学成分为其功效的基础。芍药苷及芍药内酯苷对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤有明显的保护作用[13]。芍药苷对二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化起保护作用[14];芍药苷也可通过TGF-β1/Smads信号通路对放射引起的大鼠肝纤维化起保护作用[8,15]。β-谷甾醇对小鼠肝纤维化有保护作用,其机制可能与TGFβ/Smad2/3和TNF-α-NF-κB信号通路相关[16]。可下调Ⅰ型胶原纤维和α-SMA的基因和蛋白表达[17]。

从赤芍治疗肝纤维化的“成分-靶点-疾病”交互网络中,赤芍治疗肝纤维化的效应机制可能与IL6、VEGFA、ESR1、FOS、CASP3、RELA、AR、CYCS、CASP8、PGR、CASP9、HIF1A、CCNB1等靶标基因相关。肝窦毛细血管化则肝细胞物质交换出现障碍。肝纤维化伴随肝窦毛细血管化,肝脏新生血管与肝纤维化的发生密切相关[18]。组织缺氧诱导因子(HIF-1α)促进VEGF表达和转录增强,促进新血管生成,HIF-1α/VEGF信号通路是肝纤维化的重要调节通路[19]。IL-6与肝细胞炎症坏死严重度及纤维化程度关系密切[20]。炎症机制是各种病因所致慢性肝病发生发展的一个共同过程,是肝纤维化进展的核心机制,从这一机制着手进行肝纤维化诊治具有重要价值[21]。NF-κB可通过调控多种抗炎因子的表达来影响肝纤维化的进展,NF-κB抑制剂也已在临床上得到应用。NF-κB对Ⅰ、Ⅲ型胶原基因转录上调及肝纤维化的形成具有重要调节作用[22]。肝纤维化与NF-κB信号通路的多种炎症介质有关[23],NF-κB信号通路通过对肝细胞、HSC等细胞的调节,影响肝纤维化的发展[24]。RELA是NF-κB通路中的主要活性成分,可影响肝纤维化的形成[25]。GO基因功能分析表明赤芍治疗肝纤维化关键靶标主要富集在DNA转录、复制,细胞生长、凋亡功能活动中。KEGG通路富集分析,与肝纤维化密切相关的有细胞凋亡、Th17细胞分化、IL-17信号通路、HIF-1信号通路、p53信号通路。研究表明,赤芍水提物影响bcl-2、bax、caspase-3三种蛋白表达,促进活化的HSC凋亡,减少酒精性肝纤维化的发生[26]。可见赤芍干预治疗肝纤维化具有多成分、多靶点的特点。

综上所述,本研究基于网络药理学方法探析赤芍治疗肝纤维化的分子机制,赤芍12个活性成分共作用于41个靶标,可见一个成分作用多个靶点,亦可见多个活性成分作用同一靶标,可影响细胞生长、凋亡、核受体活性、DNA转录、复制等生命活动,可通过细胞凋亡、Th17细胞分化、IL-17信号通路、HIF-1信号通路、p53信号通路干预治疗肝纤维化,多种活性成分通过多靶标、多途径、多通路、协同作用治疗HF,为赤芍治疗肝纤维化的药效物质基础及作用机制提供了参考。